第一部分启膈散对食管癌细胞粘附及迁移的影响。目的:探讨启膈散对食管癌细胞之间,以及食管癌细胞同基质之间粘附的影响,试图揭示启膈散通过增强食管癌细胞间的同质粘附,抑制食管癌细胞同基质间的粘附从而抑制食管癌细胞迁移,减少食管癌转移的机制。方法:1 肿瘤细胞间同质粘附的降低有利于肿瘤细胞脱离母体,是肿瘤发生转移的第一步。本研究选用高分化食管癌细胞TE1和低分化食管癌细胞TE13,分别应用MTT法和机械计数法检测启膈散对食管癌细胞之间同质粘附的影响。2 选用高分化食管癌细胞TE1和低分化食管癌细胞TE13,应用细胞阻抗检测技术检测启膈散对食管癌细胞同基质粘附的影响。3 选用高分化食管癌细胞TE1和低分化食管癌细胞TE13,应用细胞阻抗检测技术及划痕实验检测启膈散对人食管癌细胞迁移能力的影响。4 选用高分化食管癌细胞TE1和低分化食管癌细胞TE13,不同剂量启膈散(10μg/ml,50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml)分别作用食管癌细胞24h,48h和72h,应用MTT法检测各组食管癌细胞增殖活性。结果:1 MTT法测启膈散对食管癌细胞同质粘附的影响,结果显示,启膈散浓度为100μg/ml时细胞间的同质粘附较对照组明显增强(P<0.05)。进一步采用机械计数法检测启膈散对食管癌细胞同质粘附的影响,其结果与MTT法检测结果一致,当启膈散浓度为100μg/ml时细胞间的同质粘附明显增强(P<0.05)。2 细胞阻抗检测技术检测启膈散对食管癌细胞与基质间粘附的影响,结果显示经100μg/ml浓度启膈散作用的食管癌细胞与基质间的粘附力明显低于对照组(P<0.05)。3 划痕实验检测启膈散对食管癌细胞迁移的影响,结果显示,在启膈散浓度为100μg/ml时,食管癌细胞的迁移明显受到抑制(p<0.05),细胞阻抗检测技术结果同样证实了经启膈散(100μg/ml)作用的食管癌细胞迁移能力较对照组明显下降(p<0.05)。4 MTT法测启膈散对食管癌细胞增殖的影响,结果显示,启膈散在体外环境中对食管癌细胞增殖活性无明显影响。第二部分 启膈散对Cx32表达及食管癌细胞微丝骨架重排的影响。目的:探讨启膈散增强食管癌细胞间隙连接,抑制食管癌细胞微丝骨架重排的研究,并试图揭示启膈散增强Cx32的表达可能是抑制食管癌细胞微丝骨架重排,降低食管癌细胞迁移能力的机制。方法:1 选用高分化食管癌细胞TE1、Eca109和低分化食管癌细胞TE13,不同浓度启膈散(50μg/ml,100μg/ml)作用细胞24h,应用western blot检测食管癌细胞间隙连接蛋白Cx32的表达情况。进一步应用流式细胞术检测经启膈散(100μg/ml)作用后间隙连接蛋白Cx32在细胞膜表达情况,从而推断间隙连接蛋白Cx32的功能变化。2 选用高分化食管癌细胞TE1、Eca109和低分化食管癌细胞TE13,应用免疫细胞化学及流式细胞术测启膈散(100μg/ml)对粘附连接相关蛋白E-cadherin表达的影响。3肿瘤细胞发生转移,会从规则的上皮细胞形态转变为不规则的间质细胞形态,长出伪足,以此获得迁移能力。本次研究选用高分化食管癌细胞TE1和低分化食管癌细胞TE13,用鬼笔环肽标记食管癌细胞骨架,采用免疫荧光法观察启膈散(100μg/ml)作用后细胞形态的变化,明确启膈散对食管癌细胞形态的影响。4选用高分化食管癌细胞TE1、Eca109和低分化食管癌细胞TE13,用FITC标记的鬼笔环肽标记食管癌细胞微丝,应用激光共聚焦显微镜观察启膈散(100μg/ml)作用后食管癌细胞微丝骨架的变化。结果:1 Western blotting结果显示,食管癌细胞中Cx32的表达与启膈散浓度相关,当启膈散浓度为100μg/ml时能够明显增强Cx32的表达(p<0.05)。流式细胞术结果显示,经启膈散(100μg/ml)作用的食管癌细胞中Cx32蛋白在细胞膜的表达明显高于对照组(p<0.05)。2 免疫细胞化学法和流式细胞术结果均显示经启膈散作用的食管癌细胞和对照组相比,E-cadherin的表达未见明显增强。3 免疫荧光结果显示,经启膈散作用的食管癌细胞,伪足消失,形状规则,更接近于正常的食管上皮细胞(P<0.05)。4 激光共聚焦显微镜结果显示,经启膈散作用后的食管癌细胞中微丝排列更规则,而对照组细胞中微丝排列混乱,且以细胞膜微丝排列不规则更为明显,在细胞膜上微丝排列缺乏同向性,向外伸出细小伪足。结论:1启膈散能够增强食管癌细胞间的同质粘附同时抑制食管癌细胞同基质之间的异质粘附。2启膈散在体外环境中对食管癌细胞增殖活性无明显影响,但能够明显抑制食管癌细胞的迁移。3启膈散能够抑制食管癌细胞发生微丝骨架重排。4启膈散能够明显增强Cx32的表达及功能,这可能是抑制食管癌细胞微丝骨架重排,降低食管癌细胞迁移能力的主要机制。