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鲑鱼降钙素(calcitonin,CT )已临床应用30多年,是治疗骨质疏松、变形性骨炎、骨痛等的一线药物。在大肠杆菌或酵母中表达的降钙素,由于C-端氨基酸不能酰胺化,生物学活性很低,每毫克只有100-200 IU,因而目前降钙素的市场价格很高,注射针剂中的降钙素为12,000元/mg,原药价格也高达1.8-2万元/g。近年来人们一直在努力尝试如何利用基因工程的方法廉价生产具有生物学活性的降钙素。植物油体表达体系具有提取工艺简单,易于分离纯化的优点。现有研究资料表明,利用油菜油体表达体系表达的鲑鱼降钙素,至少能够部分酰胺化,与大肠杆菌和酵母体系相比,在生物学活性和生产成本方面具有明显优势。本研究利用高效表达鲑鱼降钙素的转基因油菜株系,建立了鲑鱼降钙素的纯化方法。通过对多种实验的比较发现,离心力和离心时间是获得高纯度油体的关键因素。利用优化后的油体蛋白提取方法,可彻底去除杂质,获得的油体呈乳白色,无可见颗粒状杂质,更细腻,也更有利于后继的凝血酶的酶切反应。通过比较提取油体蛋白后进行凝血酶酶切分离目的蛋白和提取油体直接进行凝血酶酶切的方法发现,两种方法均能用凝血酶酶切得到3.45 kD的目的带,但后者获得的降钙素量更大,酶切效率更高。msCT转基因油菜油体经凝血酶酶切后,回收水相冻干进行HPLC检测发现,可检测到降钙素特征峰,测序验证工作正在进行。针对原有技术体系的不足,根据生产企业意见,对油菜油体表达技术平台在以下4个方面进行了优化:a.引入了His-tag标记技术;b.利用肠激酶代替凝血酶作为蛋白酶切位点,使得到的降钙素的氨基酸序列与天然降钙素的完全相同;c.利用gus作为报告基因,监测转基因油菜种子的纯度;d.利用大鼠酰胺化酶基因,进一步提高降钙素的酰胺化程度。为此,我们按照双子叶植物偏爱密码子,综合考虑GC含量、肠激酶酶切位点等设计合成了天然鲑鱼降钙素基因(sCT),克隆了His-tag标记的芝麻oleosin基因,构建了以油菜oleosin启动子驱动芝麻oleosin-sCT融合蛋白基因的植物表达载体pBOsC2301,转化甘蓝型油菜品种中双4号,获得了14株转基因植株,PCR、RT-PCR、GUS检测和southern blot结果表明目的基因已整合进油菜基因组并表达。SDS-PAGE凝胶电泳发现,转基因油菜油体肠激酶酶切前后蛋白条带发生了明显改变,说明肠激酶可以对纯化的油体进行有效切割。目前正在进行目的蛋白的HPLC和His-tag亲和层析。为利用大鼠酰胺化酶PHM基因,进一步提高的鲑鱼降钙素的生物学活性,构建了植物表达载体pDOV2301。该载体包括3个独立的表达盒,分别是由拟南芥oleosin启动子驱动大豆oleosin-PHM融合蛋白基因的表达盒;以油菜oleosin启动子驱动芝麻oleosin-sCT融合蛋白基因的表达盒,以及GUS表达盒。已获得6株转基因植株,PCR检测均为阳性。本研究建立的鲑鱼降钙素的纯化方法和油体表达技术平台,对降低降钙素生产和纯化成本具有重要意义。