研究背景和目的异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)现已广泛用于血液系统与非血液系统疾病治疗,甚至是治愈某些疾病的唯一方法。移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)是目前制约allo-HSCT疗效的最主要瓶颈之一。Allo-HSCT后大约有30-80%的受者出现急性GVHD(acute GVHD,aGVHD),30～70%存活100天以上的受者可出现慢性GVHD(chronic GVHD,cGVHD)。其中,近半数患者因此并发症而死亡。GVHD不仅影响移植后患者的生存,而且影响患者的生活质量。现广泛接受的aGVHD发病机理主要是由于供受者HLA不合激活供者T细胞,针对受者组织器官发生的一种异常免疫反应。目前,临床上用于防治GVHD的方法以免疫抑制剂为主,过强的免疫抑制可导致肿瘤复发率、感染以及第二肿瘤的发生率增加。利用机体免疫系统内在的调节机制调节免疫应答和诱导免疫耐受、控制GVHD的发生与发展,同时保留机体移植物抗肿瘤(graft versus leukemia,GVL)效应和抗感染免疫已成为目前移植免疫研究的重点与焦点。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是存在于多种组织中的一种成体干细胞。因具有多向分化、免疫调节、支持造血、修复组织和炎症调节等功能,目前MSC已被广泛应用于克罗恩病、类风湿性关节炎、糖尿病和多发性硬化等疾病的治疗,其中治疗最为成功的是对GVHD的治疗。2004年,Le Blanc等首先报道1例MSC治疗难治性aGVHD获得成功的案例。随后,Le Blanc研究组在2008年又报道55例应用MSC治疗激素抵抗型aGVHD的临床研究,结果发现:30例获得完全缓解(complete response,CR),9例得到明显改善,提示MSC可能是一种很有前景的防治aGVHD产品。近年来,临床应用MSC防治GVHD的报道越来越多,尽管疗效仍存在争论,但绝大部分前瞻性和回顾性研究均表明MSC对GVHD治疗有效。当前,报道MSC调控GVHD的机理可能有:MSC抑制T细胞的增殖与功能、诱导调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)形成和增殖、抑制树突状细胞(dendritic cell,DC)成熟、影响抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APC)和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)功能及分泌免疫抑制因子如:HLA-G、转化生长因子-β3(TGF-β)和白细胞介素(interleukin,IL)10等。除此之外,近期我们研究发现MSC可通过调控B细胞改善cGVHD。MSC可增加cGVHD患者体内同种异体抗体及血浆内B细胞活化因子(B cell activating factor,BAFF)水平。但目前有关MSC调控GVHD的机理主要聚焦在MSC对外周免疫池的研究。胸腺作为T细胞发育和成熟的一级免疫组织,在构建完整的T细胞库和诱导对自身组织免疫耐受过程中发挥了重要作用。在allo-HSCT受体,移植前放化疗和移植后GVHD均可导致胸腺上皮细胞(thymic epithelial cell,TEC)损伤,进而影响胸腺的阴性和阳性选择,产生对自身组织不能产生免疫耐受的自身反应性T细胞,进一步加重GVHD的发生与发展。另一方面,在allo-HSCT移植后,供者T细胞在受者体内的的重建主要经历胸腺依赖途径和胸腺非依赖途径。供者来源的经造血干细胞分化的初始T细胞通过胸腺依赖途径的阳性与阴性选择后重建永久的T细胞免疫,同时经胸腺修饰后选择性去除自身反应性T细胞而获得对受者抗原的免疫耐受;而供者来源的成熟T细胞则经胸腺非依赖途径在外周扩增,重建移植后的早期免疫,而且经胸腺非依赖途径产生的T细胞仅使供者获得移植后短暂的早期免疫重建而不能重建完整的TCR库,该类未经胸腺修饰的T细胞不能形成对受者抗原的免疫耐受,是GVHD、尤其是aGVHD发生与发展的主要效应细胞。MSC作为胸腺基质细胞(thymic stroma cells,TSC)中的组份,除通过旁分泌:IL-4、IL-7、干扰素(interferon,IFN)γ等影响T细胞发育外,更重要的是对TEC的功能发育和再生起到十分重要作用。MSC一方面通过细胞之间的接触、旁分泌细胞因子促进TEC的功能发育和再生;另一方面,MSC在某些炎症因子的刺激下可以发挥其多向分化的潜能向TEC分化。我们前期小样本研究测定8例接受MSC治疗的难治性aGVHD患者胸腺输出功能-T细胞受体重排删除环(T cell receptor rearrangement excision circles,TRECs)水平,研究发现:MSC治疗后GVHD受者的TRECs水平显著高于同期未接受MSC治疗的GVHD受者。因此,我们提出MSC可能通过改善胸腺功能调控GVHD受体的免疫耐受和重建。目前,这方面的研究甚少。因此,从中枢免疫组织—胸腺角度出发,研究MSC调控GVHD促进免疫耐受和重建的机理,为临床建立MSC防治GVHD技术平台提供理论依据是本研究的创新点。本研究中通过构建aGVHD动物模型,建立GFP-MSC的培养扩增体系。将GFP-MSC输注到aGVHD受鼠体内,观察小鼠的生存和GVHD严重程度等;探讨MSC调控胸腺再生,促进移植后免疫重建的机理;并观察MSC对难治性aGVHD患者治疗的有效性与安全性。通过上述研究,从中枢免疫组织-胸腺角度揭示MSC对GVHD的免疫调控作用。方法1、小鼠allo-HSCT后aGVHD动物模型的构建:BALB/c小鼠经全身放疗后,接受C57BL/6供鼠骨髓(bone marrow,BM)细胞(5×106)和脾细胞(4×106)移植。移植后隔日观察受鼠GVHD表现、严重程度和生存情况;采用流式细胞术(fluorescence activated cell sorter,FACS)检测aGVHD受鼠嵌合情况;移植后28d留取受鼠各靶器官标本进行苏木素一伊红(haematoxylin eosin,HE)染色研究aGVHD引起的组织病理改变。2、绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记MSC的分离、培养、扩增和鉴定:采用改良的贴壁培养法,分离GFP标记C57BL/6小鼠BM来源的MSC。采用普通及荧光显微镜观察MSC的形态学特征;FACS测定MSC的GFP和表面抗原表达;鉴定MSC向成骨细胞和脂肪细胞的分化潜能。3、MSC控制aGVHD应用策略的研究:采用已构建的小鼠aGVHD模型,探讨MSC剂量和应用时机对aGVHD受鼠生存的影响。为研究MSC剂量对aGVHD受鼠生存的影响,将aGVHD受鼠随机分为4组,分别为MSC 1×105细胞/只、5×105细胞/只、1×106细胞/只组和非MSC处理组,观察各组小鼠的生存情况;为研究MSC应用时机对aGVHD受鼠生存的影响,aGVHD受鼠被随机分为4组,分别为allo-HSCT后+3d、+7d、+21d接受MSC组和非MSC处理组,观察各组小鼠的生存情况。4、MSC控制aGVHD的疗效研究:将aGVHD受鼠随机分为2组,分别为MSC组和非MSC处理组。MSC组采用上述研究中小鼠生存期最长的方案(5×105细胞/只于allo-HSCT后+7d输注)。移植后隔日观察两组小鼠的aGVHD表现、严重程度和生存情况;移植后28d留取两组aGVHD受鼠各靶器官的标本进行HE染色研究组织病理改变。5、MSC归巢到胸腺组织的研究:在allo-HSCT后+7d给予aGVHD受鼠GFP标记的MSC处理,同时设非MSC处理的阴性对照组。以细胞角蛋白5(cytokeratin5,K5)和细胞角蛋白8(cytokeratin8,K8)分别作为髓质TEC(medullary TECs,mTECs)和皮质TEC(cortical TECs,cTECs)的标志。采用病理免疫组织化学、FACS等技术,研究MSC在aGVHD受鼠胸腺组织的归巢情况。6、MSC对胸腺功能影响的机理研究:将aGVHD受鼠随机分为MSC组和非MSC处理组。MSC组给予GFP标记的MSC处理。移植后28d,比较两组小鼠胸腺指数和胸腺细胞计数,间接评价MSC对aGVHD受鼠胸腺的影响;采用实时荧光定量PCR(real time fluorescent quantitativ,FQ-PCR)技术,测定两组小鼠胸腺、外周血、脾细胞中TRECs情况,直接评价MSC对aGVHD受鼠胸腺输出功能的影响。7、MSC对移植后免疫重建的研究:采用FACS测定MSC处理前后不同时间点小鼠胸腺、外周血及脾脏中T细胞亚群(CD4+CD8+T,CD4+CD8T,CD4-CD8+T,CD4+CD25+Foxp3+T)的重建情况。设非MSC处理的阴性对照组。8、MSC治疗难治性aGVHD患者的临床应用研究:47例难治性aGVHD患者根据自愿原则,28例接受MSC治疗,19例未接受MSC治疗。MSC组患者在原有免疫抑制剂治疗的基础上接受MSC治疗。MSC以1 ×1 06/kg静脉输注,每周一次直到aGVHD达到完全缓解(complete response,CR)或连用8次无效即停用。对照组只接受一线和/或二线免疫抑制剂治疗。观察两组难治性a G V H D患者的治疗疗效,治疗及随访期间感染、肿瘤复发、cGVHD和生存情况;采用FACS检测MSC治疗前后患者外周血淋巴细胞亚群(CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、Foxp3+Tregs、CD19+B)比例;采用FQ-PCR技术监测MSC治疗前后患者sjTREC水平变化。9、数据统计分析采用SPSS 17.0统计软件进行处理。所有的计量资料均采用均数±标准差(x±s)形式表示。生存时间比较均采用log-rank法,生存曲线绘制采用Kaplan-Meier法;BM与GVHD组小鼠移植后嵌合情况、P3与P5代MSC成脂/成骨细胞形成率、MSC组与对照组移植后GVHD临床和病理评分的比较采用两独立样本t检验;MSC治疗前后患者淋巴细胞亚群和sjTREC变化的比较采用配对样本t检验;移植后28d BM组、MSC组与对照组间胸腺指数、胸腺细胞计数、TRECs水平及T细胞亚群的比较采用单因素方差分析,当各组方差齐时,用LSD法作进一步多重比较;方差不齐时,用Welch法校正,并用DunnettT3法作多重比较。MSC组与对照组难治性aGVHD患者有效率的比较采用卡方检验。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1、Allo-HSCT后C57BL/6→BALB/c aGVHD小鼠模型的构建:①嵌合情况:移植后+28天,BM和GVHD组小鼠的H-2Kb表达均达到97%以上,提示供鼠细胞在受鼠体内成功植入,且两组H-2Kb嵌合情况无统计学差异(P=0.436);②生存情况:BM组受鼠的存活时间大于45天,移植后可以获得长期生存。而GVHD组受鼠的中位存活时间明显短于BM组仅为23天(P<0.001),在移植后3-4周出现死亡高峰;③aGVHD表现:GVHD组受鼠移植后+7d开始出现明显的弓背、腹泻症状,后随着受鼠体重上升,腹泻等表现稍减轻,+14d后逐渐出现脱毛,活动度减低,弓背,再次出现腹泻,甚至血便。而BM组受鼠+7d后活动度,体重,精神逐渐恢复,无aGVHD临床表现出现。GVHD组小鼠的临床和病理评分均高于BM组(P<0.001),且GVHD组靶器官的病理表现为结构紊乱,组织细胞间可见炎症细胞浸润。2、GFP标记C57BL/6小鼠BM来源MSC的分离、扩增和鉴定:体外分离培养的MSC呈长梭形,均匀一致,集落排列呈漩涡状。在荧光显微镜下,细胞表达明亮的绿色荧光信号,且不随细胞传代而显著衰减。FACS检测MSC的GFP与表面标志表达情况,结果显示:P3和P5 MSC的GFP表达阳性率分别为99.14%,95.05%,无明显统计学差异(P=0.215);MSC表达表面抗原CD44、CD90、CD106、CD140a、Sca-1,不表达CD11b、CD34、CD45。体外可诱导MSC向脂肪细胞及成骨细胞分化,且P3与P5 MSC成脂/成骨细胞形成率无明显差异(P=0.856,P=0.255)。3、MSC治疗aGVHD受鼠的研究:①MSC治疗策略的研究:接受MSC(5×105细胞/只)治疗的GVHD小鼠生存期显著长于未接受MSC治疗组(P=0.014),且明显高于MSC(1×105细胞/只)组(P=0.031)。而接受MSC(10×105细胞/只)治疗的aGVHD小鼠在MSC输注后大部分会在2-5分钟内死亡,考虑小鼠死于重要脏器栓塞。因此,在一定范围内,MSC高剂量组治疗aGVHD疗效优于低剂量组;另外,移植后+3d输注MSC治疗的GVHD小鼠生存期与未接受MSC治疗组相比无明显差异(P=0.770);移植后+7d接受MSC治疗小鼠生存期明显延长(P=0.014);+21d接受MSC治疗组生存时间较未接受MSC治疗的对照组延长,但无统计学差异(P=(0.192);②MSC对GVHD的治疗效果:GVHD组受鼠在移植后+7d开始出现弓背、腹泻症状,后症状出现短暂减轻,+14d后aGVHD症状加重。而MSC组受鼠+7d接受MSC输注后,aGVHD症状得到改善,再次出现aGVHD的时间推迟到+20d左右,且+d20和d24临床评分明显低于未接受MSC治疗的对照组(P=0.048,P=0.039);移植后+28天MSC组小鼠的病理评分显著低于未接受MSC治疗的对照组(P=005)。4、MSC在组织器官归巢的研究:采用FACS发现MSC输注后d2 GFP标记的MSC在各靶器官中均有表达,且表达最强。输注后d3与d5 MSC的表达量逐渐减少,d3肺组织中已检测不到GFP-MSC的表达,d5只有肠道组织中可以检测到少量MSC;胸腺切片免疫组化显示MSC输注后d2可以定位于GVHD小鼠的胸腺组织,且主要定位在胸腺皮质近髓质的区域。5、MSC修复胸腺组织的研究:①间接评价胸腺功能:移植后GVHD组小鼠的胸腺明显小于BM组,MSC组和非MSC处理组胸腺大体标本无明显差异。同未接受MSC治疗的GVHD受鼠相比,MSC组受鼠的胸腺指数明显增高(P<0.001),但仍低于BM组(P=0.006);且MSC组受鼠胸腺细胞计数明显高于未接受MSC治疗的对照组(P=0.012),前者是后者的1.52倍,但都低于BM组(P<0.001);②直接评价胸腺功能:首先建立RAG2与TRECs标准品的标准曲线,线性系数都满足r>0.98。同正常小鼠相比,移植后+28d BM、非MSC处理组与MSC实验组受鼠胸腺、脾及外周血单个核细胞中TRECs水平均显著降低(P<0.001)。BM组胸腺细胞中TRECs水平显著高于未接受MSC治疗的对照组(P<0.001),但同接受MSC治疗组相比无明显统计学差异(P=0.058)。MSC组TRECs水平显著高于未接受MSC治疗的对照组(P=0.007);在脾单个核细胞中,BM组受鼠的TRECs水平显著高于MSC治疗与非治疗组受鼠(P=0.004;P<0.001)。然而,MSC组与非MSC处理组相比,TRECs水平无统计学差异(P=0.182);在外周血中单个核细胞中,BM组TRECs水平显著高于未接受MSC治疗的对照组(P=0.029),但同MSC实验组无明显统计学差异(P=0.240)。MSC组TRECs水平显著高于未接受MSC治疗组(P=0.017)。6、MSC对中枢免疫重建的影响:同正常BALB/c小鼠相比移植后BM、非MSC处理组与MSC组胸腺所有T细胞亚群(CD4+CD8+T、CD4-CD8+T、CD4+CD8T、CD4+CD25+Foxp3+T)均有不同程度地减少。尤其是在移植后d7,接受移植的各组T细胞比例最低,后随着移植后细胞的重建,各T细胞亚群比例逐渐增加。双阳性T细胞比例在GVHD小鼠显著减少,从移植后+14d开始逐渐提高,且+21d、+28d MSC组双阳性T细胞比例明显高于非MSC处理组(P<0.001);MSC组CD4和CD8单阳性T细胞从移植后+21d开始高于非MSC处理组,且+28dMSC组单阳性T细胞比例同非MSC处理组相比,有显著的统计学差异(P<0.001)。GVHD组CD8单阳性T细胞的重建晚于CD4单阳性T细胞,CD4单阳性T细胞移植后+21d开始重建,而CD8单阳性T细胞移植后+28d才开始重建。移植后+21d、+28d MSC组Foxp3+Tregs比例显著高于未接受MSC治疗的对照组(P<0.001)。7、MSC对外周免疫重建的影响:外周T细胞亚群的重建时间晚于中枢免疫池。在小鼠外周血和脾细胞中,CD4+CD8+双阳性T细胞在移植后+14d降到最低后随重建逐渐增加。在外周血,移植后+21d、+28d MSC组双阳性T细胞比例显著高于非MSC处理组(P<0.001)。而在脾细胞中MSC组双阳性T细胞比例同对照组相比无统计学差异(P>0.05);在外周血CD4单阳性T细胞在移植后+14d降到最低,CD8单阳性T细胞在+28d降到最低。且外周血MSC组CD4、CD8单阳性T细胞比例与非MSC处理组相比无明显的统计学差异(P>0.05)。在脾细胞中,CD4、CD8单阳性T细胞均在移植后+14d降到最低。MSC组CD4与CD8单阳性T细胞比例在移植后+21d、+28d显著高于非MSC处理组(P<0.001);移植后+21d、+28d MSC治疗组外周血中Foxp3+Tregs 比例显著高于非MSC处理组(P<0.001)。而脾细胞中MSC组Foxp3+Tregs的比例与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。8、MSC治疗aGVHD患者的临床应用研究:28例难治性aGVHD患者共接受125例次MSC输注,中位接受MSC输注4(2-8)次/例。17例获得CR,4例获得PR,OR率为75%。对照组中5例获得CR,3例获得PR,OR率为42.1%。MSC组OR率均显著高于未接受MSC治疗的对照组(P=0.023)。在aGVHD治疗期间和随访期间,CMV和EBV感染、原发病复发两组间无统计学差异。MSC组aGVHD患者的cGVHD发生率和严重程度均显著低于对照组(P=0.045,P=0.005)。MSC组CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞、Foxp3+Tregs比例和sjTREC水平在MSC治疗后显著升高。同对照组相比,MSC组Foxp3+Tregs比例和sjTREC水平在治疗后8,12周显著高于对照组。结论1、成功构建稳定的allo-HSCT后aGVHD小鼠模型。采用全身照射(TB17.0Gy)预处理方案,移植0天给予5×106个BM细胞及4×106个脾细胞输注,受鼠在移植后可成功植入,并表现出典型的aGVHD临床和病理表现。2、成功分离GFP标记C57BL/6小鼠BM来源MSC,可在体外连续扩增,即保持其稳定的GFP标记又保持其表面的生物学标志,具有良好的增殖能力和向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力。3、将MSC输注到aGVHD受鼠体内观察到:MSC输注后明显改善GVHD受鼠的生存及aGVHD临床病理评分。进一步对MSC输注剂量和时机的探讨发现:在一定剂量范围内,GVHD治疗效果与MSC的剂量成正相关;在GVHD内环境损伤严重的早期应用MSC治疗,有更好的治疗效果。4、MSC输注后归巢到胸腺并改善胸腺的再生和输出功能,促进移植后中枢和外周免疫池T淋巴细胞亚群的重建,诱导Tregs增殖,通过本文的研究初步揭示:MSC调控GVHD的机理是MSC通过影响胸腺促进GVHD受体免疫耐受和免疫重建。5.MSC对allo-HSCT后难治性aGVHD患者治疗有效,且不增加患者的感染和肿瘤复发率。同时,aGVHD患者接受MSC治疗后其cGVHD的发生率和严重程度降低。从临床上揭示了 MSC可通过改善aGVHD患者胸腺功能诱导长期免疫耐受与重建,从而发挥其调控GVHD的作用。