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目的:1.异氟烷对发育期海马神经元的凋亡作用及可能的作用机制探讨。2.EPO对异氟烷所致发育期海马神经元毒性的保护作用。方法:首先选择怀孕18-20天的孕鼠,取其胎鼠分离海马神经元,并运用免疫荧光的方法鉴定神经元特异性烯醇化酶(Neuron Specific Enolase,NSE)以此来判定分离的海马神经元纯度。将发育期海马神经元细胞随机分为3组:对照组、异氟烷组和促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)给药组。对照组和EPO+正常细胞组细胞正常培养,异氟烷组给予异氟烷溶液(0.42 mmol/L),EPO给药组则同时给予异氟烷溶液和EPO溶液(1U/ml),24后收集细胞培养液和细胞用来进行相关的检测实验。并运用四甲基偶氮挫盐(Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT)方法检测海马神经元的细胞活力;免疫印迹(Western Blot,WB)方法检测细胞凋亡相关蛋白Bax,Caspase-3,Caspase-9和Bcl-2的表达;流式细胞仪检测海马神经元的凋亡率;酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)方法检测海马神经元细胞培养液中CaMK Ⅱ的活力;孵育Fluo-3荧光探针检测海马神经元中Ca2+的浓度;免疫荧光方法检测海马神经元微丝微管的表达并测量轴突的突起长度。结果:1.本研究分离到的海马神经元培养1 d后均已贴壁;培养8 d时神经元胞体丰满,突起相互交织形成网络结构,光晕轮廓明显。经鉴定海马神经元NSE表达呈现强阳性,神经元纯度较高。2.MTT检测发现:与对照组相比,异氟烷组的海马神经元细胞活力明显降低(p<0.01),而EPO给药组的海马神经元细胞活力明显高于异氟烷组(p<0.05),且接近对照组的海马神经元活力。WB检测凋亡相关蛋白结果显示:促凋亡蛋白Bax、Caspase3和Caspase9的表达趋势一致,均表现为异氟烷组中的表达明显高于对照组(p<0.01),EPO给药组的表达与异氟烷组相比明显降低(p<0.01);抑凋亡蛋白Bcl-2的表达则与之相反,异氟烷组Bcl-2的表达明显低于对照组(p<0.01),EPO给药组中的表达明显高于异氟烷组(p<0.01)。流式细胞仪检测细胞的凋亡显示:对照组的细胞凋亡率最低,异氟烷组的海马神经元细胞凋亡率明显升高(p<0.01),而EPO给药组的细胞凋亡率低于异氟烷组,但仍然高于对照组凋亡水平,这一结果与WB结果相互对应。3.Fluo-3探针孵育后发现异氟烷组的海马神经元中Ca2+荧光强度明显高于对照组(p<0.01)检测,EPO给药组的荧光强度与异氟烷组相比明显降低(p<0.01),但仍然高于对照组神经元细胞。各组海马神经元细胞培养液中CaMK Ⅱ活力检测结果显示:与对照组相比,异氟烷组海马神经元细胞培养液中CaMK Ⅱ的活力明显降低(p<0.01);EPO给药组的CaMK Ⅱ活力明显高于异氟烷组(p<0.05),且基本恢复到对照组的水平。神经元细胞微丝微管的免疫荧光检测发现:对照组的海马神经元细胞形态较好,突起较长;与对照组相比,异氟烷组的海马神经元细胞形态不规则,突起长度明显降低(p<0.01);EPO给药组的神经元细胞形态相比于异氟烷组较好,突起长度有所延长(p<0.05),但仍然低于对照组(p<0.01)。结论:1.发育期海马神经元在异氟烷的作用下,细胞活力降低,细胞凋亡明显增加,Ca2+浓度明显增加,提示异氟烷可能是导致神经元细胞钙离子过渡累积,激活了细胞凋亡过程。2.异氟烷可导致与轴突生长锥引力密切相关的CaMK Ⅱ活力明显下降,从而影响了轴突的生长,进而能影响神经元信号的传递。3.EPO作为多功能的神经保护剂,可对异氟烷引起的神经元凋亡起到有效的缓解和保护作用。