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背景目前,全世界治疗性重组蛋白(包括重组抗体)的生产近70%是用中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞表达系统生产的。影响重组蛋白在CHO细胞中高效且稳定表达的因素很多,其中表达载体是其中最重要的因素之一。由于目的基因转入后的随机整合,以及基因沉默和不稳定表达的经常发生,限制了大规模工业化生产的发展。因此高效稳定表达载体的构建已经成为国内外学者研究的热点。目的探究不同内含子元件和polyA元件对CHO细胞转基因表达水平及稳定性的的影响及其机制。方法1.根据文献报道的内含子序列hCMV intron A(hCMVI)、TPL intron(TPLI)、SV40 intron(SVI)、CHEF1 gene intron1(CHEFI),PCR扩增或人工合成内含子片段替换原表达载体pIRES-EGFP中内含子IVS,构建含不同内含子的表达载体。2.根据文献报道的polyA序列(BGH polyA、Mutation BGH polyA、Synthetic polyA、HSV TK polyA、SV40 late polyadenylation signal),PCR扩增或人工合成polyA片段替换原表达载体pIRES-EGFP中的polyA,构建含不同polyA片段的表达载体。3.通过lip2000转染试剂将构建好的载体转染CHO-S细胞,48h后荧光显微镜下观察转染情况,流式细胞术检测其瞬时表达量和转染效率。4.细胞在加压下筛选稳定表达的克隆株,流式检测eGFP稳定表达。qPCR和RT-qPCR检测转基因拷贝数和mRNA表达。5.用阿达木抗体基因替换筛选出的高表达载体上的报告基因eGFP,构建含目的基因的表达载体转染CHO-S细胞,蛋白印迹法(Western Blot)检测阿达木抗体的表达。结果1.经酶切测序证明已成功构建重组载体。2.瞬时表达分析,与对照载体相比,内含子中的SV40内含子能够提高转染效率和瞬时表达(P<0.05);而与对照载体相比BGH polyA和Syntion polyA能够显著提高转染效率和瞬时表达(P<0.05)。3.稳定表达分析,和对照载体相比,SV40内含子和hCMV内含子均能提高CHO细胞的转基因表达(P<0.05);对调控元件ploy A,Synthetic polyA和SV40late polyA能显著提高CHO细胞的稳定转基因表达(P<0.05)。4.qPCR表明转基因表达量的高低与基因拷贝数无关。RT-qPCR检测eGFP的mRNA的表达,结果表明mRNA的表达量高低与目的基因的表达量亦不成正相关。5.Western blot检测结果表明,筛选的高表达载体在阿达木抗体中也可以提高表达。结论1.内含子中的SVI、hCMVI能够显著提高CHO细胞的转基因表达。2.PolyA中的Synthetic和SV40 late能够显著提高CHO细胞转基因表达。3.筛选的高表达载体也能提高阿达木抗体的表达。