低氧耐受和适应调节能力对于水生动物,尤其是移动能力较差的物种,具有十分重要的意义。已有研究表明魁蚶(Scapharca broughtonii)具有较强的低氧耐受能力。本研究比较了7种海洋贝类在不同溶氧下的存活情况,并对溶解氧(dissolved oxygen,DO)为0.5 mg/L胁迫下不同时间的魁蚶5个组织进行切片观察;利用Illumina Hiseq测序平台对不同浓度溶氧胁迫的魁蚶血淋巴进行测序,挖掘响应低氧胁迫的差异表达基因和通路,并克隆获得低氧诱导因子(HIF)信号通路中三个关键基因,分析了其基因结构特征和低氧胁迫下的表达特征;应用RNA干扰技术,初步探究了魁蚶HIF信号通路中HIF-1α对相关靶基因的调控作用。研究初步明确了魁蚶的耐低氧能力及其对低氧胁迫在组织及分子层面的响应,丰富了海洋贝类在该领域的相关研究内容。具体结果如下:(1)对比了魁蚶、毛蚶(Scapharca subcrenata)、青蛤(Cyclina sinensis)、江户布目蛤(Protothaca jedoensis)、四角蛤蜊(Mactra veneriformis)、丽文蛤(Meretrix Cusoria)和菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)等7种海洋贝类在DO为0.5 mg/L、2.5 mg/L和4.5 mg/L胁迫不同时间的生存状态和死亡率,并计算半致死浓度。结果显示:DO为0.5 mg/L实验组的死亡率显著高于2.5 mg/L和4.5 mg/L实验组;0.5 mg/L胁迫4 h,实验组中毛蚶、青蛤和江户布目蛤出现死亡,处理至120 h的死亡率分别达到55%±3.2%、48%±2.2%和45%±5.8%,显著高于魁蚶、四角蛤蜊、丽文蛤、菲律宾蛤仔四组;胁迫9 d,魁蚶、四角蛤蜊、丽文蛤、菲律宾蛤仔、毛蚶、青蛤和江户布目蛤的死亡率分别为44%±2.2%、48%±1.2%、65%±2%、68%±4.7%、74%±3.8%、88%±4.2%和100%。处理同一时间点,魁蚶处理组的LC50明显低于丽文蛤、菲律宾蛤仔、毛蚶、青蛤和江户布目蛤这5个实验组;在处理3 d以前,魁蚶和四角蛤蜊LC50差异不显著。低氧胁迫不同时间段魁蚶鳃、外套膜、斧足肝、胰腺和闭壳肌5个组织的组织切片观察结果表明,DO为0.5mg/L胁迫120 h内,魁蚶的斧足和闭壳肌的肌肉组织结构没有明显变化,而另外三个组织在120 h时可观察到较为明显的组织损伤。处理24 h,鳃丝结构开始发生变化,主要表现为鳃丝纤毛数量增多,鳃丝之间的接触面积增加,鳃丝腔扩张,鳃丝腔内结缔组织变薄,且腔体内红细胞比例增加,处理72 h开始,红细胞比例减少,白细胞比例增加,鳃丝腔开始重新收缩;处理24 h,外套膜组织中的红细胞比例显著增加,白细胞比例减少,至72 h时开始显著降低,外套膜的结缔组织开始逐步出现细胞融合现象,120 h以后,外套膜的结缔组织细胞融合加剧,结缔组织出现疏松散乱。处理24 h,肝胰腺组织中的红细胞比例开始增加,出现细胞融合现象;72 h时,红细胞比例降低,细胞融合现象加剧,肝胰腺组织开始变得松散。(2)三个魁蚶血淋巴RNA样品的比较转录组测序共获得185366条unigenes,其中NR库中己获得注释的46,123 unigenes共比对上935个不同的物种。KEGG Pathway差异富集性分析结果显示2040个差异基因共富集到153个Pathways,这些信号通路参与主要的代谢途径和信号转导通路涉及PI3K-AKT信号通路(PI3K-AKT signaling pathway)、碳代谢(Carbon metabolism)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)和HIF信号通路(HIF-1 signaling pathway)等免疫、代谢和细胞增殖等相关主要通路。选取10个差异基因采取荧光定量验证,结果显示这些qRT-PCR验证的结果与mRNA测序结果虽然有些表现出倍数上的差异性,但是上下调趋势是相同的,这一结果验证了转录组测序分析的准确度。(3)以转录组获得的片段为基础,结合RACE和qRT-PCR技术克隆获得了魁蚶HIF-1α基因(SbHIF-1α,GenBank号:MH936548)、HIF-1β基因(SbHIF-1β,GenBank:号MH936549)和ENO-1基因(SBENO-1,GenBank号:MK575044)cDNA全长序列,并研究了不同实验条件下mRNA表达特征。SbHIF-1α、SbHIF-1β和SBENO-1基因cDNA全长分别为2741 bp、3110 bp和2411 bp,三个ORF编码711、717和603个氨基酸残基,预测蛋白分子量分别为80.8 kDa、78.4 kDa和66.5 kDa,理论等电点为5.57、6.63和5.29,预测含有两个糖基化位点,一个脯氨酸羟化酶结合位点LxxLAP;软件预测SbHIF-1α和SbHIF-1β基因基因均包含一个HLH结构域、两个PAS结构域和一个PAC结构域,SBENO-1基因含有一个Enolase-N结构域和一个Enolase-C结构域。利用Mega 6.0软件的Maximum likelihood模型构建的进化树显示三个基因的分子进化地位与其生物学分类地位大体保持一致。qRT-PCR检测SbHIF-1α、SbHIF-1β和SBENO-1基因在血淋巴、鳃、外套膜、斧足、闭壳肌和肝胰腺6个组织中的表达,发现SbHIF-1α基因在六个组织中的相对表达量由高到低分别是血淋巴、鳃、外套膜、斧足、闭壳肌和肝胰腺,血淋巴中表达量最高值是肝胰腺的11.63倍,差异达到极显著水平(P<0.01);SbHIF-1β基因的表达量由高到低顺序是血淋巴、外套膜、鳃、肝胰腺、斧足和闭壳肌,相对于闭壳肌,SbHIF-1β在在血淋巴中表达量最高,是闭壳肌的12.16倍,达到极显著水平的差异(P<0.01);SBENO-1基因组织表达高低顺序是鳃、血淋巴、肝胰腺、外套膜、闭壳肌和斧足,最高值是最低值的14.23倍,也达到极显著差异(P<0.01)。三个基因在DO为0.5 mg/L、2.5 mg/L、4.5 mg/L的低氧胁迫下的六个组织中的表达特征:三个基因在0.5 mg/L实验组中的相对表达量的差异显著性高于2.5mg/L和4.5 mg/L实验组,且在每个组织中的相对表达量在一定处理时间后显著高于对照组,其中血淋巴和鳃比其他四个组织的表达量差异更显著。血淋巴中SbHIF-1α的表达量变化趋势是逐步升高,而其他五个组织的表达变化趋势是先升高再降低再升高的趋势,血淋巴中,DO为0.5 mg/L胁迫4 h后,SbHIF-1α的表达量较对照组即达到极显著差异(P<0.01),胁迫64 h后,表达量达到最高,是对照组的519.43倍。低氧胁迫0.5 mg/L和2.5 mg/L处理组SbHIF-1β的变化趋势更明显,SbHIF-1β的表达量变化趋势是先降低再升高,在8 h时相对表达量与对照组达到极显著差异水平,36 h时变化量达到最大值,随后降低,显著水平都达到极显著水平(P<0.01),整体来看,鳃、血淋巴和肝胰腺中SbHIF-1β相比其他组织表达量更显著,最低值时,对照组分别为其24倍和19.43倍。血淋巴中SBENO-1相比其他组织响应较为积极,表达量显著高于其他组织,最高值为对照组的89.25倍,表达量随胁迫时间增加而总体趋势是先升高,在24 h后有逐步下调的趋势,鳃中SBENO-1的表达量趋势与血淋巴相似,而SBENO-1这种升高后降低再升高的变化趋势也体现斧足、闭壳肌和肝胰腺中,0.5 mg/L实验组斧足、闭壳肌和肝胰腺中SBENO-1的最大值分别是对照组的6.98、32.31和12.69倍,都达到极显著水平(P<0.01)。本研究明确了SbHIF-1α、SbHIF-1β和SBENO-1的基因结构特征、时空表达特征及对低氧胁迫的响应规律,丰富了海洋贝类HIF通路基因的研究资料。(4)对魁蚶HIF-1α基因进行dsRNA干扰,检测干扰后SbHIF-1α及其靶基因一氧化氮合酶(NOS)、运铁蛋白(TF)、促红细胞生成素(EPO)、血红素氧合酶(Ho)和烯醇酶(ENO)基因各时相的表达情况。结果表明,SBHIF-1α基因在干扰24 h开始降低,在48-72 h,SBHIF-1α基因的相对表达量显著降低(P<0.05);降低一直持续到96 h,之后基因表达量开始回调。在SBHIF-1α被抑制表达后,SBHIF-1β基因在48 h-72 h显著上调表达(P<0.05),表明HIF两个亚基基因的表达可能有相互抑制的调节作用;相比对照组,实验组中各靶基因的表达量,在SBHIF-1α被干扰48 h-96 h后出现了显著性下调(P<0.05)。