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以木质纤维素水解产物为原料来生产生物乙醇在能源和环保等方面具有重大的意义.构建能同时有效发酵六碳糖(葡萄糖、果糖)和五碳糖(木糖、阿拉伯糖)生产乙醇的重组运动发酵单胞菌(Z mobilis)菌株是本实验室的研发项目之一,本文工作为该项目的一部分,在运动发酵单胞菌中有效表达木糖利用必需的两个基因,即大肠杆菌木糖异构酶基因(xylA)与木酮糖激酶基因(xylB).
首先应用重叠延伸PCR技术,构建重组质粒pZB21.Peno-xylAB,使得xylAB位于Peno(Z mobilis烯醇化酶基因的启动子)下游,受Peno控制.通过电穿孔转化技术将其引入Z mobilis CP4.转化子XI与XK活性最高分别达0.239U/mg蛋白.和0.418U/mg蛋白.该结果说明在Z mobilis CP4自身启动子PenD的控制下,E.coli的xy/AB可以在Z mobils CP4中正确的转录与翻译.
应用PCR技术扩增Pgap(Z mobilis磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子),构建pBSKS-Pgap-xylAB使得xylAB位于Pgap下游,受其控制.将pBSKS-Pgap-xylAB中含有Pgap-xylAB的DNA片段分别插入两个穿梭载体pZB21与pZA22,构建重组质粒pZB21-Pgap-xylAB与pZA22-Pgap-xylAB,电穿孔转化运动发酵单胞菌.转化子的XI酶活分别为0.420、0.403U/mg蛋白,XK酶活分别为0.532、0.517U/mg蛋白.说明Pgap可以正确启动E.coB的xylAB在Z.mobilis中的转录与翻译.而载体pZB21、pZA22对xylAB的表达作用也相当,XI、XK酶活水平基本一致.
Peno、Pgap都可以有效启动E.coli的xylAB在Zmobilis中的转录与翻译.酶活分析说明eno、gap基因启动子对xylAB的表达作用相当,粗酶液SDS-PAGE电泳图谱上可观察到XI、XK条带.
本工作为下一步构建利用木糖的运动发酵单胞菌工程菌菌株打下了基础.