大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是一种高致病性的食源性致病菌,10个细菌就能致病,它能引起人类急性腹泻、呕吐、高烧和败血症等疾病,因此,快速而准确地检测大肠杆菌O157:H7具有重要意义。传统的大肠杆菌O157:H7检测方法时间较长,因此,研制快速检测大肠杆菌O157:H7的方法对于应急检测而已是必要的。我国是猪肉食用大国,因此防控猪肉中的大肠杆菌O157:H7污染对我国来说尤为重要。本文致力于建立一种适用于基层的快速检测猪肉中大肠杆菌O157:H7的胶体金免疫层析方法。本文对快速检测大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析试纸条的稳定性、灵敏度、特异性进行评价后,将其应用于猪肉检测。当使用中国标准前增菌方法对猪肉进行前增菌培养时,发现无论是在本实验制备的试纸条上还是在杜邦公司商品化的试纸条上,对大肠杆菌O157:H7阴性肉样的检测频繁地出现假阳性,从这些假阳性肉样中筛选出了一株弗氏柠檬酸杆菌,查阅相关文献得知,某些弗氏柠檬酸杆菌和大肠杆菌O157:H7表面有相似的O157抗原,因此使用免疫学方法检测时极易发生交叉反应导致假阳性结果。本文通过改进前增菌培养基配方(改良的麦康凯肉汤培养基),优化其添加的添加剂浓度(噻孢霉素浓度为0.1mg/L,亚碲酸钾浓度为5 mg/L),防止假阳性反应的发生。将此培养基用于培养猪肉样品后,使用胶体金试纸条进行检测。2 CFU/g大肠杆菌O157:H7污染的猪肉检出率为100%,同时一定程度的消除了弗氏柠檬酸杆菌导致的假阳性反应。证明本文研究的方法适用于猪肉中大肠杆菌O157:H7的检测。在传统试纸条的基础上,本文研究了一种大肠杆菌O157:H7双金新型免疫层析试纸条,可以有效地提高大肠杆菌O157:H7的检测灵敏度。胶体金免疫层析试纸条T线上包被兔抗大肠杆菌O157:H7多抗,C线上包被抗鼠二抗。胶体金标记抗鼠二抗后,与另一胶体金标记的抗大肠杆菌O157:H7单抗结合,因此在试纸条的检测线上就有两种不同的胶体金颗粒,起到增强显色信号的目的。本文研究了两种模式的信号放大试纸条。一类为直接信号放大法,将金标单抗固定在金垫上,与金标抗鼠二抗充分混合的样品液加入到试纸条上进行反应。另一类是间接信号放大法,将金标单抗与样品液充分混合,反应3 min后,再加入金标抗鼠二抗混匀,加入到试纸条上反应。对金标大肠杆菌O157:H7单抗和金标抗鼠二抗的两种胶体金的粒径进行系统性研究,结果显示,使用28 nm金标抗大肠杆菌O157:H7单抗和45 nm金标抗鼠二抗相互作用时,可以将大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析试纸条检测灵敏度提高20倍。以脱脂牛奶为基质做实验时,肉眼判读检测灵敏度达到1.14×103 CFU/mL,比传统方法提高了两个数量级。