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背景
心肌梗死(myocardial infarction)是冠心病导致死亡最主要的原因,在我国占据很高的发病率和死亡率。由于长时间的心肌缺血缺氧，心肌细胞发生不可逆的死亡，由此引发的心功能下降及心室重构是最终导致心力衰竭或猝死的主要原因。因此防止MI后心肌细胞大量丢失及心肌重构是心梗预后及治疗的关键。
程序性坏死(necroptosis)作为一种新型程序性细胞死亡方式，具有坏死样形态特征，但受某些信号分子的调控。其中受体相互作用蛋白1(receptor-interacting protein kinase 1 ，RIP1 )，受体相互作用蛋白3(receptor-interacting protein kinase 3，RIP3)是调控necroptosis主要信号因子，混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)则参与了necroptosis执行过程。研究发现在已敲除RIP3的小鼠中，缺血再灌后其心肌坏死及心衰的发展得到缓解；在压力负荷造成的心肌肥厚中也发现心肌细胞线粒体损伤严重时也伴随着RIP1、RIP3蛋白表达的明显上调；提示，necroptosis参与了心血管疾病的发生发展过程，但在心肌梗死过程中的具体调控机制目前研究较少。
作为溶酶体依赖的降解途径，自噬(autophagy)的激活可以清除错误折叠的蛋白及损伤的细胞器，在为细胞提供能量及维持细胞稳态中发挥关键作用。以往的研究认为自噬对细胞的存活大多起保护作用，然而最近研究表明自噬失调与细胞的死亡息息相关，但自噬是否参与了心肌梗死后心肌细胞的丢失过程及其对心肌细胞丢失的调控机制如何目前尚不明确。
自噬和necroptosis作为除凋亡途径外两种可调控的参与了细胞死亡的方式，很可能参与了心肌梗死后心肌细胞丢失过程，但其调控机制如何仍有待了解。因此本课题通过体内构建心肌梗死模型，体外建立氧葡萄糖剥夺模拟缺血缺氧过程，观察自噬活性和necroptosis在心肌梗死过程中的作用并探讨对心肌细胞丢失及心功能的影响。旨在为心肌梗死的临床治疗提供更多治疗途径及寻找新的作用靶点。
第一部分自噬和necroptosis在小鼠心肌梗死后心肌重构中的作用
目的
观察C57BL/6小鼠在心肌梗死诱导心肌重构过程中自噬及nercoptosis的变化情况
方法
结扎冠状动脉左前降支(LAD)建立小鼠心肌梗死模型，小动物超声成像系统检测心功能；称重及计算心脏体重比，用TTC染色法检测心肌梗死面积；Westernblot法检测心脏梗死周边区自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、beclin1、p62的表达及necroptosis相关蛋白RIP1、RIP3的表达情况。
结果
1.与假手术组(sham)相比，MI组小鼠心脏体重比在4周后明显增加(p＜0.05),梗死面积随缺血时间延长而不断增大。
2.与sham组相比，MI小鼠LVAW、心脏收缩功能指标---射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)从1周开始明显减小(p＜0.05)，LVPW从2周开始明显减小；提示MI组小鼠从1周后开始收缩功能下降；MI组小鼠心脏舒张功能指标---等容舒张时长(IVRT)和等容收缩时长(LVCT)明显增加，舒张早期二尖瓣环速率e/舒张晚期二尖瓣环速率a(e/a)在术后第四周开始明显减小，二尖瓣血流E峰/A峰(E/A)比值在1~4周前下降，第八周后比值明显升高(p＜0.05)。提示，小鼠MI术后4周舒张功能开始下降。
与sham组比较，小鼠MI后8~12周，ET明显增加，心输出量(Co)显著减小(p＜0.05)。提示，小鼠MI后8~12周随着收缩和舒张功能下降的同时已逐渐发展到心衰过程。
3.与sham组相比，MI组小鼠梗死周边区自噬相关蛋白beclin1表达明显增加，LC3Ⅱ/Ⅰ在术后1~12周表达降低，p62则在术后1~12周表达增加(p＜0.05)；提示小鼠MI后随时间延长自噬流明显被抑制。
4.与sham组比较，MI后1~12周necroptosis相关蛋白RIP3、RIP1表达明显上调(p＜0.05)，提示小鼠MI后诱导了necroptosis。
小结
1.MI小鼠随缺血时间延长，心功能不断下降并伴随心肌自噬障碍。
2.MI小鼠心肌necroptosis相关蛋白RIP3，RIP1表达明显上调，提示心肌梗死诱导了necroptosis。
第二部分自噬和necroptosis在缺血缺氧诱导H9C2心肌细胞丢失过程中的作用及可能机制
目的
探讨自噬和necroptosis在缺血缺氧诱导H9C2心肌细胞死亡过程中的作用。
方法
体外氧葡萄糖剥夺(OGD)建立H9C2心肌细胞缺血缺氧模型，采用MTT、PI/Hochest双染色法检测细胞的死亡情况；Westernblot法检测LC3Ⅱ/Ⅰ、beclin1、p62的表达及RIP1、RIP3的表达情况；m-RFP-GFP-LC3腺病毒转染H9C2检测自噬体和自噬溶酶体的变化；细胞免疫荧光法检测MLKL在OGD过程中分布变化。
结果
1.OGD时间依赖性地诱导H9C2心肌细胞死亡。且与0h相比，OGD处理3h自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、beclin1的表达明显上调，p62的表达明显下调，且自噬体及自噬溶酶体数量明显增多，但在OGD处理12h后p62表达明显增加(p＜0.05)，自噬溶酶体数量显著减少；并且各时间点经CQ预处理后与未经CQ处理组相比，在OGD处理12h后LC3Ⅱ/Ⅰ、p62表达水平没有明显差异(p＞0.05)。2.与0h组比较，OGD组中necroptosis相关蛋白RIP3、RIP1的表达明显上调(p＜0.05),MLKL发生了由胞浆向胞膜转位。
3.与OGD组比较，CQ预处理及beclin1knockdown组可以明显促进OGD诱导的细胞死亡，上调RIP3的表达；而beclin1过表达组则对上述指标有抑制作用。
4.与OGD组比较，RIP3过表达组促进OGD诱导的细胞死亡，而RIP3knockdown则对OGD诱导的细胞死亡有改善作用。
小结
1.心肌细胞缺血缺氧过程伴随自噬障碍，并诱导了necroptosis。
2.自噬障碍可能介导了OGD过程中心肌细胞necroptosis，改善自噬障碍及抑制necroptosis可以减少OGD诱导的心肌细胞丢失。
第三部分调控自噬和necroptosis对小鼠心肌梗死后心肌重构及心功能的影响
目的
探讨通过调控自噬和necroptosis对MI小鼠的心脏功能及心肌重构的影响方法
C57BL/6小鼠心肌局部多点注射beclin1及RIP3过表达及shRNA慢病毒以调控心肌beclin1及RIP3表达；小动物超声成像系统检测各组小鼠心功能；TTC染色法检测心肌梗死面积，透射电镜检测自噬及心肌超微结构的变化。masson染色检测心肌纤维化。
结果
1.从术后2周开始,beclin1过表达组与MI组小鼠相比，LVAW、LVPW及FS明显改善，并观察到小鼠心肌组织细胞排列较整齐，但可见纤维架桥；而beclin1shRNA组和CQ组小鼠从术后1周开始心肌收缩功能参数---LVAW、LVPW、EF和FS较MI组明显恶化，且舒张功能在2周左右明显恶化，并观察到小鼠心肌组织排列紊乱，心肌纤维化明显，心肌损伤加重。
2.从术后1周开始,RIP3过表达组小鼠与MI组相比，LVAW、LVPW、EF和FS明显恶化，舒张功能在4周开始明显恶化，且小鼠心肌细胞排列疏松，心肌纤维化及心肌受损加重；而从术后2周开始，RIP3shRNA组小鼠较MI小鼠收缩舒张功能参数均有改善(p＜0.05)，且小鼠心肌组织细胞排列较整齐，心肌纤维化也明显改善，心肌损伤明显减轻。
小结
1自噬障碍及necroptosis恶化心梗小鼠心功能，诱导心室重构及心肌损伤。抑制necroptosis则有效改善MI小鼠心功能，减缓心肌纤维化及心肌损伤。
2激活自噬可以使MI小鼠在早期心功能得到改善，但随时间延长有可能通过介导心肌重塑过程促进心衰。
全文结论
1.心肌梗死后的心室重构过程伴随自噬障碍及necroptosis。
2.心肌自噬障碍可能介导了necroptosis，并参与心肌细胞的丢失及心肌重构过程。
3.抑制necroptosis可以有效减轻心肌纤维化及心肌损伤，改善心梗小鼠心功能。
心肌梗死(myocardial infarction)是冠心病导致死亡最主要的原因,在我国占据很高的发病率和死亡率。由于长时间的心肌缺血缺氧，心肌细胞发生不可逆的死亡，由此引发的心功能下降及心室重构是最终导致心力衰竭或猝死的主要原因。因此防止MI后心肌细胞大量丢失及心肌重构是心梗预后及治疗的关键。
程序性坏死(necroptosis)作为一种新型程序性细胞死亡方式，具有坏死样形态特征，但受某些信号分子的调控。其中受体相互作用蛋白1(receptor-interacting protein kinase 1 ，RIP1 )，受体相互作用蛋白3(receptor-interacting protein kinase 3，RIP3)是调控necroptosis主要信号因子，混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)则参与了necroptosis执行过程。研究发现在已敲除RIP3的小鼠中，缺血再灌后其心肌坏死及心衰的发展得到缓解；在压力负荷造成的心肌肥厚中也发现心肌细胞线粒体损伤严重时也伴随着RIP1、RIP3蛋白表达的明显上调；提示，necroptosis参与了心血管疾病的发生发展过程，但在心肌梗死过程中的具体调控机制目前研究较少。
作为溶酶体依赖的降解途径，自噬(autophagy)的激活可以清除错误折叠的蛋白及损伤的细胞器，在为细胞提供能量及维持细胞稳态中发挥关键作用。以往的研究认为自噬对细胞的存活大多起保护作用，然而最近研究表明自噬失调与细胞的死亡息息相关，但自噬是否参与了心肌梗死后心肌细胞的丢失过程及其对心肌细胞丢失的调控机制如何目前尚不明确。
自噬和necroptosis作为除凋亡途径外两种可调控的参与了细胞死亡的方式，很可能参与了心肌梗死后心肌细胞丢失过程，但其调控机制如何仍有待了解。因此本课题通过体内构建心肌梗死模型，体外建立氧葡萄糖剥夺模拟缺血缺氧过程，观察自噬活性和necroptosis在心肌梗死过程中的作用并探讨对心肌细胞丢失及心功能的影响。旨在为心肌梗死的临床治疗提供更多治疗途径及寻找新的作用靶点。
第一部分自噬和necroptosis在小鼠心肌梗死后心肌重构中的作用
目的
观察C57BL/6小鼠在心肌梗死诱导心肌重构过程中自噬及nercoptosis的变化情况
方法
结扎冠状动脉左前降支(LAD)建立小鼠心肌梗死模型，小动物超声成像系统检测心功能；称重及计算心脏体重比，用TTC染色法检测心肌梗死面积；Westernblot法检测心脏梗死周边区自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、beclin1、p62的表达及necroptosis相关蛋白RIP1、RIP3的表达情况。
结果
1.与假手术组(sham)相比，MI组小鼠心脏体重比在4周后明显增加(p＜0.05),梗死面积随缺血时间延长而不断增大。
2.与sham组相比，MI小鼠LVAW、心脏收缩功能指标---射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)从1周开始明显减小(p＜0.05)，LVPW从2周开始明显减小；提示MI组小鼠从1周后开始收缩功能下降；MI组小鼠心脏舒张功能指标---等容舒张时长(IVRT)和等容收缩时长(LVCT)明显增加，舒张早期二尖瓣环速率e/舒张晚期二尖瓣环速率a(e/a)在术后第四周开始明显减小，二尖瓣血流E峰/A峰(E/A)比值在1~4周前下降，第八周后比值明显升高(p＜0.05)。提示，小鼠MI术后4周舒张功能开始下降。
与sham组比较，小鼠MI后8~12周，ET明显增加，心输出量(Co)显著减小(p＜0.05)。提示，小鼠MI后8~12周随着收缩和舒张功能下降的同时已逐渐发展到心衰过程。
3.与sham组相比，MI组小鼠梗死周边区自噬相关蛋白beclin1表达明显增加，LC3Ⅱ/Ⅰ在术后1~12周表达降低，p62则在术后1~12周表达增加(p＜0.05)；提示小鼠MI后随时间延长自噬流明显被抑制。
4.与sham组比较，MI后1~12周necroptosis相关蛋白RIP3、RIP1表达明显上调(p＜0.05)，提示小鼠MI后诱导了necroptosis。
小结
1.MI小鼠随缺血时间延长，心功能不断下降并伴随心肌自噬障碍。
2.MI小鼠心肌necroptosis相关蛋白RIP3，RIP1表达明显上调，提示心肌梗死诱导了necroptosis。
第二部分自噬和necroptosis在缺血缺氧诱导H9C2心肌细胞丢失过程中的作用及可能机制
目的
探讨自噬和necroptosis在缺血缺氧诱导H9C2心肌细胞死亡过程中的作用。
方法
体外氧葡萄糖剥夺(OGD)建立H9C2心肌细胞缺血缺氧模型，采用MTT、PI/Hochest双染色法检测细胞的死亡情况；Westernblot法检测LC3Ⅱ/Ⅰ、beclin1、p62的表达及RIP1、RIP3的表达情况；m-RFP-GFP-LC3腺病毒转染H9C2检测自噬体和自噬溶酶体的变化；细胞免疫荧光法检测MLKL在OGD过程中分布变化。
结果
1.OGD时间依赖性地诱导H9C2心肌细胞死亡。且与0h相比，OGD处理3h自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、beclin1的表达明显上调，p62的表达明显下调，且自噬体及自噬溶酶体数量明显增多，但在OGD处理12h后p62表达明显增加(p＜0.05)，自噬溶酶体数量显著减少；并且各时间点经CQ预处理后与未经CQ处理组相比，在OGD处理12h后LC3Ⅱ/Ⅰ、p62表达水平没有明显差异(p＞0.05)。2.与0h组比较，OGD组中necroptosis相关蛋白RIP3、RIP1的表达明显上调(p＜0.05),MLKL发生了由胞浆向胞膜转位。
3.与OGD组比较，CQ预处理及beclin1knockdown组可以明显促进OGD诱导的细胞死亡，上调RIP3的表达；而beclin1过表达组则对上述指标有抑制作用。
4.与OGD组比较，RIP3过表达组促进OGD诱导的细胞死亡，而RIP3knockdown则对OGD诱导的细胞死亡有改善作用。
小结
1.心肌细胞缺血缺氧过程伴随自噬障碍，并诱导了necroptosis。
2.自噬障碍可能介导了OGD过程中心肌细胞necroptosis，改善自噬障碍及抑制necroptosis可以减少OGD诱导的心肌细胞丢失。
第三部分调控自噬和necroptosis对小鼠心肌梗死后心肌重构及心功能的影响
目的
探讨通过调控自噬和necroptosis对MI小鼠的心脏功能及心肌重构的影响方法
C57BL/6小鼠心肌局部多点注射beclin1及RIP3过表达及shRNA慢病毒以调控心肌beclin1及RIP3表达；小动物超声成像系统检测各组小鼠心功能；TTC染色法检测心肌梗死面积，透射电镜检测自噬及心肌超微结构的变化。masson染色检测心肌纤维化。
结果
1.从术后2周开始,beclin1过表达组与MI组小鼠相比，LVAW、LVPW及FS明显改善，并观察到小鼠心肌组织细胞排列较整齐，但可见纤维架桥；而beclin1shRNA组和CQ组小鼠从术后1周开始心肌收缩功能参数---LVAW、LVPW、EF和FS较MI组明显恶化，且舒张功能在2周左右明显恶化，并观察到小鼠心肌组织排列紊乱，心肌纤维化明显，心肌损伤加重。
2.从术后1周开始,RIP3过表达组小鼠与MI组相比，LVAW、LVPW、EF和FS明显恶化，舒张功能在4周开始明显恶化，且小鼠心肌细胞排列疏松，心肌纤维化及心肌受损加重；而从术后2周开始，RIP3shRNA组小鼠较MI小鼠收缩舒张功能参数均有改善(p＜0.05)，且小鼠心肌组织细胞排列较整齐，心肌纤维化也明显改善，心肌损伤明显减轻。
小结
1自噬障碍及necroptosis恶化心梗小鼠心功能，诱导心室重构及心肌损伤。抑制necroptosis则有效改善MI小鼠心功能，减缓心肌纤维化及心肌损伤。
2激活自噬可以使MI小鼠在早期心功能得到改善，但随时间延长有可能通过介导心肌重塑过程促进心衰。
全文结论
1.心肌梗死后的心室重构过程伴随自噬障碍及necroptosis。
2.心肌自噬障碍可能介导了necroptosis，并参与心肌细胞的丢失及心肌重构过程。
3.抑制necroptosis可以有效减轻心肌纤维化及心肌损伤，改善心梗小鼠心功能。