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研究背景:糖尿病膀胱功能障碍(Diabetic Bladder Dysfunction,DBD)是糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)的一个常见并发症。又称糖尿病性膀胱病(Diabetic cystopathy,DCP),发生机制目前认为与高血糖导致的膀胱逼尿肌功能障碍和外周自主神经病变相关,且肌源性和神经源性两大因素协同发挥作用,最终通过膀胱兴奋性、顺应性、收缩性的改变导致DM膀胱功能受损。膀胱逼尿肌细胞的变化直接体现上述损伤改变。DM膀胱逼尿肌超微结构的改变,细胞相关收缩蛋白的结构受损是膀胱逼尿肌收缩功能障碍最主要的结构基础。因此如何有效保护逼尿肌结构、促进其恢复具有重要的临床意义。新研究提示热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)起稳定细胞骨架结构的作用,同时发挥了重要的调节平滑肌收缩的作用。钙介质素(Caldesmon,Ca D)是一种细肌丝收缩相关蛋白,在调节平滑肌收缩中起着非常重要的作用,而在DM表达增高。新近研究表明,HSP27的磷酸化能竞争性抑制Ca D与原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)的结合影响结肠平滑肌的收缩。我们课题组前期实验结果表明HSP27在DBD大鼠膀胱中表达下降,提示HSP27与Ca D的相互作用可能与DBD中膀胱收缩功能障碍发生有密切联系。如果这一过程参与了DBD膀胱收缩功能障碍的发病,那么调节HSP27的表达或磷酸化水平,增加HSP27对Ca D调节作用,是否能对膀胱收缩功能有保护作用,其具体机制是什么是本课题希望解决的问题。本课题对逼尿肌细胞中HSP27及Ca D的研究有助于深入理解DBD的发生机制、探索逼尿肌收缩功能障碍的保护措施和治疗靶点并为预后评估提供新的依据。DBD发病率高,临床疗效差。DBD是DM的一个常见并发症,占DM患者的40%-100%。即使在血糖控制稳定的患者中,仍有25%的DBD发病率。DBD起病隐匿,进展无症状,易被医患双方忽视,最终出现包括慢性尿潴留,充盈性尿失禁,伴不可逆性或继发性尿路感染,反流性肾积水,肾功能损害等在内的由于膀胱收缩功能障碍所引起的严重影响生活质量的并发症。DBD膀胱在超微结构常以逼尿肌的退化性改变为主要特征。肌丝滑行理论解释了肌收缩原理。不同于骨骼肌,因为没有肌钙蛋白,平滑肌的收缩需要更多的依赖类似于肌钙蛋白作用的细肌丝收缩相关蛋白来介导,从而实现在缺乏肌钙蛋白和胞质Ca2+变化的情况下,经由这些细肌丝收缩相关蛋白介导以及这种介导上游的某种调控机制来共同完成平滑肌的收缩。DM中膀胱逼尿肌(detrusor smooth muscle,DSM)的功能发生改变,这种改变与其收缩相关蛋白及上游调控机制的关系尚不清楚。HSP27作为一种重要的分子伴侣,平滑肌组织在应激状态下HSP27的表达和活化状态可代偿性增加并有助于维持和重建肌细胞的收缩功能。磷酸化后HSP27产生功能活性。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是HSP27磷酸化的上游信号通路。p-HSP27Ser15、p-HSP27 Ser78和p-HSP27 Ser82是热休克蛋白27的p38 MAPK途径可激活的磷酸化位点,Ser15位于N,Ser78、Ser82位于C端。磷酸化的HSP27可通过抑制丝状肌动蛋白(F-Actin)的解聚和促进球状肌动蛋白(G-Actin)的聚合发挥稳定平滑肌细胞骨架和增强细胞收缩力的功能,但是HSP27对肌动蛋白的聚合和稳定作用机制目前尚不完全清楚。HSP27在糖尿病膀胱平滑肌收缩功能中的作用亦尚未见报道。Ca D及TM为代表的细肌丝收缩相关蛋白,在调节平滑肌收缩中起着非常重要的作用。Ca D大小为-87KD,是一种细肌丝相关蛋白,能与Actin和TM结合,此时TM位于Actin单体的外缘,封闭了Actin上的myosin的结合位点,阻碍myosin的头部与Actin的结合,从而调节平滑肌的收缩。近期研究表明,在兔DBD模型中,膀胱逼尿肌的Ca D、TM等种细肌丝收缩相关蛋白的表达增高,膀胱逼尿肌的收缩力降低,但其具体的调节机制不清楚。磷酸化HSP27可与Ca D结合,导致Ca D与TM的解离,从而暴露出Actin上的mysoin的头部结合位点,myosin与Actin的结合,调节结肠平滑肌的收缩。这一作用及机制尚未在DBD中报道。我们前期实验结果表明在DBD大鼠逼尿肌中HSP27的表达下降,既往研究还发现在兔的DBD模型膀胱逼尿肌细胞中Ca D、TM等细肌丝相关收缩蛋白表达升高,但DM状态膀胱逼尿肌收缩的调节机制不清楚。我们推测:DBD逼尿肌细胞结构功能受损,Ca D等相关收缩蛋白表达增多,但HSP27表达下降,HSP27与Ca D结合减少,故而Ca D与TM的结合增多,TM封闭Actin上的mysoin的头部结合位点,从而致膀胱逼尿肌处于舒张状态,逼尿肌收缩无力。本研究的主要策略:本项目拟选ZDF大鼠作为DM大鼠模型,并利用HSP27特异性磷酸化抗体,检测DBD逼尿肌HSP27表达及磷酸化水平的改变;以及调节HSP27磷酸化后离体逼尿肌条收缩相关功能的变化,初步验证HSP27对DBD后逼尿肌收缩功能的影响;为了明确HSP27的表达及磷酸化与Ca D、TM等相关收缩蛋白之间的相互作用在DBD的关系,我们通过调节体外培养逼尿肌细胞中HSP27的磷酸化水平改变(基因转染)后检测HSP27与Ca D、TM的共表达变化;激光共聚焦检测磷酸化HSP27与Ca D等收缩相关蛋白的相互定位关系,探讨其在稳定肌动蛋白结构、调节平滑肌收缩中的作用机制。研究一调节HSP27磷酸化改变糖尿病大鼠的膀胱收缩功能的研究目的:研究正常大鼠与ZDF(zucker diabetic fatty)糖尿病大鼠膀胱收缩功能的差异,超微结构差异。方法:将2月龄ZDF雄性大鼠DM组(n=20)高糖高脂饲养,将2月龄SD雄性大鼠对照组(n=20)正常饮食条件下饲养,16周后检测大鼠的空腹血糖,行尿动力学检测(膀胱残余尿量、最大膀胱容量、最大膀胱压力);透射电镜检测DM组与对照组膀胱逼尿肌组织超微结构改变情况;用HSP27磷酸化p38MAPK途径的特异性抑制剂和激动剂SB203580(C21H16FN3OS)和Anisomysin(ab120495 C14H19NO4)预处理肌条,分别检测HSP27去磷酸化或过磷酸化对肌条收缩力和收缩频率的影响。结果:DM组膀胱收缩功能和逼尿肌牵张力低于SD组大鼠,糖尿病大鼠膀胱逼尿肌超微结构发生明显退行性变化。DM组牵张力显著低于SD组;HSP27磷酸化途径特异性的抑制剂SB203580刺激肌条后DM组及SD组肌条牵张力降低;HSP27磷酸化途径特异性的激动剂Anisomysin刺激后DM组及SD组肌条收缩力升高。SD组抑制后牵张力与未经处理DM组无显著差异;DM组抑制后与未经处理DM组无显著差异;DM组激动后牵张力与未经处理SD组无显著差异。结论:1.DBD膀胱收缩力显著降低ZDF糖尿病雄性大鼠是理想的2型糖尿病研究动物模型,血糖明显高于正常大鼠,膀胱逼尿肌最大排尿压力显著低于正常大鼠。2.DBD膀胱结构退化用电子显微镜检测逼尿肌超微结构与对照相比,糖尿病组ZDF大鼠的逼尿肌细胞肥厚、肿胀,细胞内肌丝减少和萎缩。3.DBD的逼尿肌牵张力明显低于正常组,趋势与膀胱排尿压一致。4.DBD中HSP27磷酸化起重要的调节作用:针对正常组,下调其HSP27的磷酸化水平,牵张力可降低到与糖尿病组相近;针对糖尿病组,上调其HSP27的磷酸化水平,牵张力可接近正常组;而下调其HSP27的磷酸化水平,牵张力无更明显降低。研究二高糖对大鼠逼尿肌组织及细胞的HSP27及磷酸化水平Ca D、TM的表达影响及机制研究目的:研究糖尿病膀胱组织HSP27及其磷酸化位点Ser15、Ser78、Ser82以及Ca D、TM的表达差异;不同浓度葡萄糖是否对逼尿肌细胞HSP27及磷酸化水平表达和相关收缩蛋白Ca D、TM的表达有影响;3 D-HSP27和3G-HSP27经慢病毒转染逼尿肌细胞后是否对HSP27及相关收缩蛋白Ca D、TM的表达有影响。方法:利用免疫荧光染色,组织学检测DM组与对照组膀胱HSP27和Ca D、TM的表达与分布情况;用QRT-PCR和Western-blot的方法检测DM膀胱及对照组膀胱中HSP27的转录和表达水平差异。利用特异性的磷酸化抗体标记检测HSP27 Ser15、Ser78和Ser82的磷酸化水平变化。用QRT-PCR和Western-blot的方法检测DM膀胱及对照组膀胱中Ca D、TM等相关收缩蛋白的转录和表达水平差异。SD大鼠断颈处死,超净工作台内开腹,取出膀胱,去黏膜层并剪碎后移入10ml 0.1%胶原酶P消化液的离心管中,37℃孵育45min到1h,漂洗后细胞悬液重悬于含10%FBS的DMEM培养基中;培养基中正常葡萄糖浓度(5m M)为对照组,高葡萄糖浓度(50m M)为干预组,通过免疫荧光染色和westernblot检测48h后HSP27在逼尿肌细胞表达和磷酸化水平,通过QRT-PCR和Western-blot的方法检测逼尿肌细胞中Ca D、TM的转录和表达水平差异。构建、纯化LV5-3G-HSP27和LV5-3D-HSP27过表达慢病毒包装,通过LV5-3G-HSP27 homo、LV5-3D-HSP27 homo及LV5 NC阴性对照病慢毒载体系统转染逼尿肌细胞。细胞在静息状态或0.1u M乙酰胆碱刺激后,收集体外培养的逼尿肌细胞裂解后提取细胞蛋白,然后通过免疫共沉淀和免疫印迹技术分析磷酸化的HSP27与收缩相关蛋白(Ca D、TM)的结合能力。将p EYFP-HSP27分别和p ECFP-Ca D、p ECFP-TM的质粒共转染膀胱逼尿肌细胞,培养48h后,激光共聚焦显微镜检测蛋白共定位情况。结果:膀胱组织中HSP27在糖尿病膀胱大鼠模型中表达下降,并且其三个磷酸化亚型(Ser15、Ser78和Ser82)均显著低于正常对照组;而Ca D和TM显著高于正常对照组;高糖培养组的SD大鼠逼尿肌细胞数明显低于正常糖浓度。逼尿肌细胞培养中,QRT-PCR检测高糖培养组Ca D和TM在逼尿肌细胞的表达高于正常糖浓度组;免疫荧光检测HSP27在高糖培养组中表达下降,并且其三个磷酸化亚型(Ser15、Ser78和Ser82)均显著低于正常对照组;Western blot检测高糖组下HSP27在糖尿病膀胱大鼠模型中表达下降,并且其三个磷酸化亚型(Ser15、Ser78和Ser82)均显著低于正常对照组,而Ca D和TM显著高于正常对照组。LV5-3D-HSP27过表达慢病毒转染体外培养的膀胱平滑肌细胞,HSP27与Ca D共沉淀增加,LV5-3G-HSP27过表达慢病毒转染体外培养的膀胱平滑肌细胞,HSP27与Ca D共沉淀减少,HSP27和TM共沉淀呈阴性;激光共聚焦下p EYFP-HSP27和p ECFP-Ca D共转染组HSP27的分布与Ca D分布共定位非常接近,p EYFP-HSP27和p ECFP-TM共转染组HSP27的分布与TM分布无明显相关性。结论:1.HSP27及其磷酸化水平在糖尿病膀胱组织和体外高糖培养的逼尿肌细胞中表达、分布和转录水平降低,而Ca D和TM平滑肌收缩相关蛋白表达和分布增高;其中HSP27磷酸化水平的下调使逼尿肌细胞结构失去稳定性,是糖尿病膀胱收缩功能降低的主要原因之一。2.膀胱逼尿肌收缩机制之一可能为:磷酸化的HSP27增加了Ca D与其的结合,并使之发生结构变异,释放出TM,结合肌动蛋白产生收缩;而糖尿病状态下,低磷酸化水平的HSP27结合Ca D能力降低,Ca D与TM更多的绑定在一起,而TM无法与肌动蛋白结合,使收缩力下降。综上所述,我们在组织层面利用2型糖尿病ZDF雄性大鼠模型完成膀胱压力测试及对超微结构的观察,并揭示高糖中HSP27磷酸化表达下降使逼尿肌的收缩结构和收缩功能活性下调可能是DBD的发病机制。其中收缩力的下调可以通过HSP27磷酸化的抑制剂或激动剂所改变。2型大鼠模型中将DBD与HSP27的磷酸化及相关收缩蛋白对平滑肌收缩功能的调节联系起来,来探寻DBD肌源性改变的趋势及其机制。在细胞层面研究高糖对大鼠膀胱逼尿肌相关收缩蛋白及磷酸化转录和表达的影响。并揭示高糖下调了HSP27及其磷酸化水平,而上调了Ca D和TM的表达。在通过过磷酸化的HSP27经慢病毒转染逼尿肌细胞发现HSP27磷酸化激活了Ca D的磷酸化并与之结合,使被Ca D绑定的TM释放而促进收缩的发生,从而解释了糖尿病的氧化应激从上游下调了HSP27磷酸化而上调了Ca D,而Ca D的活性也需要在磷酸化的HSP27激活下与HSP27结合发生结构变异才能释放TM,使肌肉收缩。故可以作出以下推测:(1)糖尿病导致HSP27和磷酸化的HSP27减少,这种下调导致Ca D更多的与TM绑定而收缩功能下降;糖尿病导致氧化应激诱导了更多的Ca D,而上调的Ca D因为缺乏磷酸化HSP27的激活失去活性,导致其也绑定了更多的TM;这是DBD中HSP27参与调节的收缩功能降低的主要机制;(2)可能TM活性也需要磷酸化HSP27来激活,糖尿病诱导TM表达增多同时因为降低的磷酸化HSP27而减少了激活,也导致DBD中TM不能结合肌动蛋白实现调节收缩的活性。综上,糖尿病状态下,因为高血糖的影响,HSP27、磷酸化HSP27以及逼尿肌细肌丝收缩相关蛋白表达发生改变并均处于低活性状态,这使作用相当于骨骼肌中肌钙蛋白的这组平滑肌肌丝运动相关蛋白对收缩的开关调节功能难以保持在正常水平上。该推测揭示了DBD发生的肌源性相关的分子病理生理学机制。