研究目的:　　结直肠癌是中国第五大常诊断癌症和癌症死亡原因，也是美国第四大常诊断癌症和第二大癌症死亡原因，目前尚缺乏安全有效，特别是持久有效的药物。肿瘤异质性和肿瘤干细胞被认为是造成癌症耐药和复发的根本原因，因此，要有效治疗癌症，特别是要治愈癌症，就必须靶向肿瘤异质性细胞群体，特别是其中的干性癌细胞。天然小分子化合物咖啡酸3，4-二羟基苯乙酯(CADPE)是一种具有自主知识产权、广谱抗癌活性的小分子化合物，来源于具有清热解毒、抗肿瘤作用的中药肿节风，本课题进一步研究CADPE的抗肠癌活性，特别是对肠癌细胞株群体中各种异质性癌细胞和癌干细胞的清除作用，初步探究其作用机制，并与靶向抗癌新药Regorafenib进行对比研究，以揭示CADPE潜在抗癌药效特色。　　研究方法:　　(1)通过考察CADPE对6株具有不同生物学特征的肠癌细胞(HCT-116，HCT-15，SW620，HCT-8，HT-29和CT26.WT)、正常肠肌成纤维细胞(CCD-18Co)和3株肠癌干细胞(HCT-116CSCs，HCT-15CSCs和HCT-8CSCs)的体外增殖能力的影响，以明确CADPE对异质性肠癌细胞的抗癌活性和对正常肠细胞的安全性;　　(2)通过撤药回长实验，采用SRB法和细胞免疫荧光化学法，考察CADPE或Regorafenib处理后存活下来的细胞的回长能力，以明确CADPE和Regorafenib能否杀灭异质性群体中的各种癌细胞;(3)通过半整体实验考察CADPE或Regorafenib预处理后存活的细胞的成瘤能力，以进一步明确药物对细胞株群体中各种异质性癌细胞的杀伤作用;(4)通过干性环境成球实验考察CADPE或Regorafenib预处理后存活的细胞的成球能力，以明确药物对于高干性特征细胞的自我更新能力的影响;(5)以HCT-116为对象，采用Transwell侵袭实验考察CADPE抑制肠癌细胞侵袭的能力;(6)通过干细胞成球实验考察CADPE抑制肠癌干细胞自我更新的能力;(7)采用流式细胞术检测CADPE诱导肠癌干细胞凋亡作用;(8)采用Western Blot法考察CADPE对肠癌细胞和肠癌干细胞相关蛋白的影响。　　研究结果:　　(1)CADPE具有显著的体外抗肠癌细胞活性，且对正常肠细胞高度安全　　CADPE对不同突变类型的肠癌细胞均有显著的细胞增殖抑制作用，且呈剂量依赖性，对各株肠癌细胞的IC50值范围为5.15～32.30μM。Regorafenib对不同突变类型的肠癌细胞也有剂量依赖性的抑制作用，对各株肠癌细胞的IC50值范围为0.94～6.99μM。同时，CADPE对正常肠肌成纤维细胞不敏感，具有高度安全性。　　(2)CADPE清除肠癌细胞株群体中各种异质性癌细胞，而Regorafenib无此作用　　CADPE处理后的肠癌细胞无体外增殖能力，分化培养条件下不回长:在体外将肠癌细胞以CADPE和Regorafenib处理至存活率仅为5％～20％，撤药继续培养，Regorafenib处理组细胞增殖明显，大量回长;CADPE组仅有少量细胞回长或几乎无细胞增殖，甚至能诱导细胞进一步死亡，表现为细胞核和细胞骨架进一步瓦解。CADPE预处理后的肠癌细胞无成瘤力，体内移植瘤模型中不成瘤:CADPE预处理组未见肿瘤组织生成，无瘤重数据，而Regorafenib预处理组有肿瘤组织形成，低剂量组成瘤率为100％，瘤重为1.02±0.49g，高剂量组成瘤率85.7％，瘤重为0.29±0.167g。结果说明CADPE可消除而Regorafenib仅能减弱癌细胞的成瘤能力。CADPE预处理后的肠癌细胞无自我更新能力，干性培养条件下不形成干性球:CADPE预处理组成球不明显，且呈剂量依赖性，而Regorafenib预处理组有大量致密的干性细胞球形成。CADPE下调肠癌细胞干性分子标志物的蛋白水平:CADPE处理后的肠癌亲本细胞，干性分子标志物CD133，Notch1，Bmi-1均显著下调;Regorafenib的药效远不及CADPE。　　(3)CADPE杀伤肠癌干细胞　　CADPE抑制肠癌干细胞的细胞活力:CADPE可剂量依赖性地杀伤肠癌干细胞，CADPE对各株肠癌干细胞的IC50值范围为10.06～38.25μM;CADPE抑制肠癌干细胞的自我更新能力:空白对照组中，HCT-116CSCs成球率达28.8％±1.5％，HCT-15CSCs成球率达22.8％±3.5％，且生长迅速，最大直径达200μm。而CADPE给药组，HCT-116CSCs和HCT-15CSCs中CADPE25μM的成球率分别为2.67％±0.1％，0.3％±0.1％，CADPE50μM的成球率分别为2.33％±0.1％，0.3％±0.1％，成球速度缓慢，最大直径仅勉强达50μm;CADPE分散瓦解肠癌干性球:CADPE处理组的干性细胞球大量解体或明显皱缩，瓦解的细胞球周围还可以观察到凋亡小体;CADPE诱导肠癌干细胞凋亡:CADPE具有剂量依赖性诱导肠癌干细胞HCT-116CSCs和HCT-15CSCs凋亡的能力，HCT-116CSCs在CADPE25μM，50μM，100μM的作用下，凋亡率分别为32.0％±1.49％，41.1％±2.37％和63.1％±3.68％，HCT-15CSCs在CADPE25μM，50μM，100μM的作用下，凋亡率分别为18.7％±2.29％，43.7％±1.55％和50.6％±1.23％;CADPE下调肠癌干细胞干性分子标志物的蛋白水平:CADPE处理后的肠癌干细胞，干性分子标志物CD44，CD133和Bmi-1的蛋白水平显著下调，其中以Bmi-1的蛋白水平下调最为明显。　　(4)CADPE下调周期、凋亡相关调控蛋白及促癌关键转录因子　　CADPE处理后的肠癌干细胞，其中细胞周期调控关键蛋白CDK4、CDK6和cyclinD1，以及抗凋亡蛋白Bcl-XL、Mcl-1、survivin的蛋白水平显著下调，且促癌关键转录因子Stat3、Notch1和c-Myc的蛋白水平也显著下调。　　研究结论:　　CADPE能显著地抑制肿瘤细胞的生长增殖和在体成瘤，清除肠癌细胞株群体中各种异质性癌细胞（包括癌干细胞）。特别是，CADPE在对异质性癌细胞群体的药效和对正常肠细胞的安全性方面，要优于肠癌治疗靶向药Regorafenib。CADPE可阻滞肠癌干细胞的周期，并诱导其发生凋亡。其作用机制与CADPE广泛下调肠癌干细胞中促癌蛋白的水平有关，这些促癌蛋白包括转录因子Stat3、Notch1和c-Myc、细胞周期调控关键因子CDK4、CDK6和cyclinD1以及抗凋亡蛋白Bcl-XL、Mcl-1和survivin。以上研究结果预测CADPE具有避免癌症耐药和复发的特性。