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中国水仙(Narcissus tazetta var. chinensis)是石蒜科水仙属多年生草本植物,是我国著名的十大传统名花之一,其花清新高雅,造型美观,是冬春重要的时令花卉,深受人们喜爱。但长期以来中国水仙存在花色单一、品种单一等问题,不能满足市场的需求。通过转基因手段对水仙进行品种改良是一条有效的途径。本研究以福建漳州水仙为材料,在以中国水仙花葶为试材建立高效再生体系的基础上,初步研究了中国水仙以花葶作为受体材料的遗传转化体系;并提取了漳州水仙花色素,运用高效液相色谱法(HPLC)分析了花瓣和副冠中色素成分和含量,研究结果为利用基因工程手段培育中国水仙新品种奠定基础。主要研究结果如下:1.花葶取材:中国水仙花葶在11月中下旬花芽分化完成之后才开始伸长生长。12月、1月和2月份的花葶的长度和成熟度不同,且下端与鳞茎相连幼嫩的部位诱导芽的能力强。取12月份花葶1 cm左右,1月份是1-1.5 cm,则2月份的花葶较长可以取1.5 cm左右,将花葶切成1-2 mm薄片作为外植体。2.花葶为外植体高效再生体系的建立:试验对不同时期的花葶直接诱导芽进行了研究,并建立了适合于转基因研究的高效再生体系。比较3个不同时期花葶直接诱导芽的能力;12月份花葶以MS基本培养基附加激素5 mg·L-1 BA、0.3 mg·L-1 NAA诱导不定芽效果较好;1月份花葶以MS+ 5 mg·L-1 BA+ 0.3 mg·L-1 NAA或MS+ 3 mg·L-1 BA+ 0.5 mg·L-1 NAA两种培养基较好;2月份花葶在培养基MS+ 3 mg·L-1 BA+ 0.5 mg·L-1 NAA上不定芽分化较好。三个时期花葶不定芽诱导率都达到90%以上,分化系数达到5以上。研究还发现花葶在接种时需要将形态学上端朝上放置才易诱导出芽。不定芽在MS+ 0.5 mg·L-1 BA+ 0.3 mg·L-1 NAA壮苗培养基上可生长成健壮的小鳞茎。3.花葶为外植体遗传转化初步研究:用农杆菌EHA105/pCMBIA2300-35S-LLFY-OCS对中国水仙进行转化。抑菌剂浓度梯度试验结果显示羧苄青霉素在浓度为300 mg·L-1、头孢霉素在浓度500 mg·L-1时就可以抑制根癌农杆菌的生长;抗生素浓度梯度试验结果表明30 mg·L-1卡那霉素浓度适合于转化后的筛选。对影响转化的因素进行了比较研究,花葶在MS+ 5 mg·L-1 BA+ 0.5mg·L-1 NAA+ 3%蔗糖培养基中预培养6 d后,用OD600值为0.4的农杆菌重悬液浓度侵染30 min,共培养4 d后,转入筛选培养基MS+ 5 mg·L-1 BA+ 0.5 mg·L-1 NAA+ 30 mg·L-1 Kan+ 300 mg·L-1 Carb+ 3%蔗糖进行筛选,能获得较多抗性芽。4.花色素成分分析:对漳州水仙花的白色花瓣和黄色副冠的类胡萝卜素类色素进行提取,采用高效液相色谱法(HPLC)分析成分并测定了其含量。提取液甲醇、乙酸乙酯、石油醚体积比为1: 1: 1混合,在低温条件下可将类胡萝卜素很好的分离。色谱条件为色谱柱Luna(C18)反相柱(5μm 4.6*250 mm),流动相为0-10 min乙腈:甲醇:二氯甲烷= 70: 25: 5,20-30 min为乙腈:甲醇:二氯甲烷= 45: 10: 45。检测波长:445 nm,流速:1.0 ml/min,柱温:25℃。结果表明中国水仙花色素的主要成分是叶黄素和β-胡萝卜素,黄色副冠中叶黄素含量高于β-胡萝卜素,白色花瓣中两种色素含量都很少。