目的:关节软骨损伤,是最常见的年龄相关性的退行性疾病之一,在世界范围内有着很高的发病率。关节软骨自身再生能力较弱,软骨损伤后常常发展为骨性关节炎,由于自身的祖细胞难于获得、软骨损伤后周围组织缺乏血供以及关节软骨细胞本身迁移产生细胞外基质的能力弱等内在原因,软骨组织损伤后不同于人体其他组织缺乏足够的再生能力,为了解决这个困境,细胞移植技术可以为软骨再生提供新的方法和思路。移植修复理想的种子细胞不但要来源广泛、数量巨大,还要保证有旺盛的繁殖能力,能够在短时间扩大自身的规模数量,除此之外,该种子细胞还能分泌出足量的细胞外基质,完成相应的生物学功能。截止到目前为止,使用较为广泛的种子细胞有两种:一种是成纤维细胞,但是这种细胞来源比较匮乏,规模比较小,而且在生长过程中出现衰变的可能性比较大;第二种是骨髓间充质细胞,这种细胞的规模也比较小,分化能力较弱,无法满足生物修复的需要。而脂肪干细胞,即Adipose Stem Cells,英文缩写为ADSCs,不仅来源广泛,而且成活率非常高,分化能力非常强,在特定条件下,可以根据人们的需求分化成软骨细胞、肌腱细胞等。除此之外,脂肪干细胞的生产繁殖能力旺盛,抗衰老性能良好,必将成为修复软骨损伤的重要种子细胞来源。截止到目前为止,脂肪干细胞在软骨损伤修复中的应用还没有取得突破性的研究成果,这是因为软骨损伤部位无法生成另脂肪干细胞分化的物质。就目前来看,要想使脂肪干细胞向着软骨细胞分化,进而修复损伤的软骨组织,需要一种特殊的细胞物质。骨形态发生蛋白-7,英文缩写为BMP-7,属于TGF-β系列的细胞物质,虽然无法直接促使软骨组织的生成,但是可以使骨髓间充质细胞分化成软骨组织。还有专家学者指出:骨形态发生蛋白可以提高Ⅱ型胶原质和弹性蛋白的生物性能,对软骨组织抗压能力的提高具有重要的促进作用。本实验利用脂质体载体介导的骨形态发生蛋白-7(BMP-7)体外基因转染ADSCs为治疗策略,将BMP-7基因导入鼠脂肪干细胞(ADSCs),植入大鼠软骨损伤的动物模型中,观察软骨修复的效果,对创新发展软骨损伤组织修复的治疗方法提供了可靠的指导作用。研究方法:第一部分,鼠脂肪干细胞的原代培养及鉴定:自体脂肪干细胞的采集和培养:局部备皮消毒后无菌切取大鼠肾周围脂肪约3cm~3,处理后加入5倍脂肪组织体积的浓度为0.1%的I型胶原酶消化一个小时,离心处理后清除上层的浮脂,用200目的滤网进行过滤处理;经过离心处理后取得的沉淀以完全培养基悬浮;最后移到细胞培养瓶中,放置在温度为37摄氏度、湿度为饱和湿度、二氧化碳浓度为5%的环境中。两天之后更换细胞培养液,之后每两天换一次细胞培养液。脂肪干细胞的鉴定:细胞形态学特征(光镜、电镜观察);细胞免疫表型(CD106、CD44、CD49d);多项分化能力(向成骨细胞诱导分化)。第二部分,真核表达质粒pcDN3.1+BMP-7进行重组,并对其进行测序验证分析;合成一个稳定表达BMP-7基因的pcDNA3.1+BMP-7-ADSCs细胞株,并采用免疫荧光以及Western-Blot检测BMP-7表达;RT-PCR检测转基因的脂肪干细胞Ⅱ型胶原的表达,同时在相差显微镜下用免疫荧光方法检测Ⅱ型胶原的表达情况。第三部分:大鼠软骨损伤动物模型的建立:SD大鼠经口服谷氨酸钠-碘乙酸(monosodium iodoacetate,MIA)诱发骨软骨损伤后,膝关节行组织固定石蜡包埋切片,HE、甲苯胺蓝染色后行OARIS骨关节炎评分鉴定模型。8周后采用脊椎脱臼法处死并显露膝关节关节软骨,观察转染的脂肪干细胞移植入后的BMP-7表达及对软骨损伤的修复情况:分组情况:移植BMP-7目的基因转染的脂肪干细胞组,单纯移植脂肪干细胞组,骨关节炎模型组,正常对照组。疗效的评估:移植细胞后8周,组间对照,测量指标如下,关节软骨损伤修复情况的观察:利用免疫组化的方法检测各组Ⅱ型胶原的表达情况,Western blot方法检测各组Ⅱ型胶原的表达。结果:第一部分,鼠脂肪干细胞的原代培养及鉴定:培养的脂肪干细胞无论是原代细胞,还是传代细胞,生长繁殖状态都比较良好,两代的细胞状态基本相同,有的是长梭形,有的呈多边形。细胞免疫表型检测细胞膜的CD44、CD49d检测结果都呈阳性,但是CD106的检测结果呈阴性,除此之外,地塞米松、茜素红染色以及β-甘油磷酸钠诱导组茜素红染色的检测结果呈阳性,证实培养的脂肪干细胞具有多向分化能力;对ADSCs细胞增殖曲线进行深入分析可以看出:传代处理之后的脂肪干细胞生长繁殖能力较强。第二部分:重组骨形态发生蛋白基因质粒的重建和脂肪干细胞向软骨细胞分化的验证结果:构建了一个完善合理的真核表达质粒pcDNA3.1+BMP-7的细胞株,转染鼠脂肪干细胞的真核表达质粒pcDNA3.1+BMP-7转染处理成功;脂肪干细胞在骨形态发生蛋白转染处理之后,分化繁殖能力依旧良好,与没有经过处理的骨形态发生蛋白的脂肪干细胞相比,有效地表现出高表达Ⅱ型胶原的生物性能。第三部分:大鼠软骨损伤动物模型的建立:HE和软骨番红固绿染色提示软骨损伤组组较对照组有软骨损伤的改变,Mankin评分提示实验组存在软骨损伤,差异有统计学意义。观察转染的脂肪干细胞移植入后的BMP-7表达及对软骨损伤的修复情况;移植细胞后8周,免疫组化染色检测COLⅡ在移植转基因细胞组与正常组更为接近,具有明显的优势,利用蛋白质印迹法进行验证分析得出,移植BMP-7目的基因转染的脂肪干细胞组,Ⅱ型胶原含量与正常软骨最为接近,比移植干细胞组和模型组要高得多,差异有统计学意义。结论:1.碘乙酸膝注射关节腔的方法制作软骨损伤模型,实验组软骨表面粗糙,部分或全层缺失的病理状态,通过Mankin评分表明骨关节炎模型被成功建立。2.BMP-7转染脂肪干细胞体内移植修复关节软骨损伤,与对照组相比,实验组动物模型软骨基质形态向正常形态恢复,软骨细胞明显增多,排列类似正常的软骨细胞,软骨基质排列基本正常,具有一定的修复作用。3.Western-Blot检测移植转BMP-7基因脂肪干细胞组模型COLⅡ的表达高于对照组,差异有统计意义。