长期高强度运动训练可引发运动员心脏窦房结（sinoatrial node, SAN）的多种功能障碍，包括窦性心动过缓、窦性心律不齐、病态窦房结综合征等，在运动比赛中可导致猝死风险的增加。SAN起搏活动与细胞膜上多种离子通道有关，包括：HCN、L-Ca²⁺、T-Ca²⁺、I_Kr、I_Ks、I_KATP等，而SAN功能障碍与其细胞膜上离子通道的改变密切相关。运动医学领域对于运动训练诱发SAN功能障碍的发生机制尤其是电生理学及分子生物学机制鲜见报道，因此，本研究即以SAN细胞膜上离子通道的电生理活动（第一部分力竭运动对大鼠SAN起搏活动相关离子通道电流的影响）和结构组成（第二部分力竭运动对大鼠SAN相关离子通道亚基mRNA和蛋白质表达的影响）为切入点，着力探讨力竭运动状态下，心脏SAN细胞起搏活动相关离子通道电生理学和基因水平的改变，揭示运动引发SAN功能障碍发生的离子通道机制，为进一步探索SAN细胞离子通道的功能调节和信号转导机制、运动性心律失常的预防措施及临床治疗等奠定理论和实验基础。第一部分力竭运动对大鼠窦房结起搏活动相关离子通道电流的影响研究目的：探讨两周力竭运动对大鼠SAN细胞HCN通道、L-Ca²⁺通道、T-Ca²⁺通道、快激活整流K⁺通道、慢激活整流K⁺通道、ATP敏感型K⁺通道I_f、I_Ca,L、I_Ca,T、I_Kr、I_Ks、I_KATP电流的影响。实验分组：将180只健康雄性SD大鼠随机分为9组，每组20只，包括安静对照组（C组）、一次力竭组（O组）、反复力竭组（R组），各组大鼠分别于运动后即刻（0h）、4小时（4h）、12小时（12h）、24小时（24h）不同时相取材，一次力竭运动各组大鼠分别以O-0h、O-4h、O-12h、O-24h命名，反复力竭运动各组大鼠分别以R-0h、R-4h、R-12h、R-24h命名，以观察运动结束后SAN细胞膜上离子通道I_f、I_Ca,L、I_Ca,T、I_Kr、I_Ks、I_KATP电流密度变化与时间的关系。动物模型建立：安静对照组不施加任何运动影响，反复力竭各组大鼠尾部负重为体重的3%，每天1次，每周6天游泳训练，每次运动时间控制在2小时左右，共运动2周；一次力竭运动各组大鼠正常喂养两周后，进行一次性力竭游泳运动，运动方案同反复力竭组。模型建立完成后，测量大鼠心电图及相关血液学指标以判断模型建立效果。研究方法：1.大鼠SAN细胞急性分离：采用Langendorff灌流及酶消化法急性分离大鼠SAN细胞。2.全细胞膜片钳记录SAN细胞各通道电流：应用全细胞膜片钳技术分别记录各组SAN细胞膜上I_f、I_Ca,L、I_Ca,T、I_Kr、I_Ks、I_KATP共6个通道电流密度的变化。3.数据统计：全细胞膜片钳实验结果以通道电流密度数值表示，电流密度为电流强度与膜电容的比值（pA/pF），其中电流强度为实验所测量电流峰值，膜电容为实验中记录到的单个细胞电容值。实验结果中各通道电流密度以均数±标准差（x±S）表示，数据采用SPSS13.0软件及EXCEL软件中单因素方差分析（ANOVA），各实验组与对照组之间的显著性差异采用SNK法，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为非常显著性差异。研究结果：1.力竭运动对大鼠心电图和相关血液学指标的影响：心电图指标结果：反复力竭运动后，心电图显示窦性心动过缓发生率为20%；窦性心律不齐发生率为2.5%，ST-T出现明显升高，心肌缺血的发生率为5%。血液学指标：一次力竭运动及反复力竭运动后大鼠肌红蛋白、血清肌钙蛋白I和肌钙蛋白T出现不同程度升高，表明心肌出现微损伤。2.力竭运动对大鼠SAN细胞If电流的影响：与对照组-29.11±2.63pA/pF相比，一次力竭运动对于大鼠窦房结HCN通道If电流密度无明显影响，反复力竭各时相组If电流密度显著下降（P<0.01）。这一结果可能导致SAN细胞舒张期自动去极化的负性变时效应，从而引起SAN细胞起搏活动的减慢。3.力竭运动对大鼠SAN细胞ICa,L电流的影响：对照组SAN细胞ICa,L电流密度为-7.78±0.76pA/pF，一次力竭运动各时相组无明显变化，反复力竭即刻组R-0h电流密度为-6.19±0.38pA/pF，较对照组及一次力竭各组显著下降（P<0.05），反复力竭其它时相组的电流密度均下降，分别为-6.26±0.06pA/pF、-6.22±0.95pA/pF和-6.33±0.68pA/pF，低于对照组及一次力竭O-0h组（P<0.05，P<0.05，P<0.05）。4.力竭运动对大鼠SAN细胞ICa,T电流的影响：与对照组ICa,T电流密度为-11.23±0.79pA/pF相比，一次力竭运动各时相组电流密度无明显变化，反复力竭即刻组R-0h电流密度为-6.89±1.42pA/pF，较对照组及一次力竭各组下降，且具有显著性差异（P<0.01），反复力竭其它时相组的电流密度均下降，分别为-6.62±0.42pA/pF、-7.02±0.84pA/pF和-6.58±0.56pA/pF，与对照组及一次力竭各组相比，均具有显著性差异（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。5.力竭运动对大鼠SAN细胞IKr电流的影响：与对照组大鼠SAN细胞IKr电流密度为1.73±0.04pA/pF相比，一次力竭运动各时相组电流密度无明显变化，反复力竭即刻组R-0h电流密度为0.93±0.05pA/pF，较对照组及一次力竭各组下降，且具有显著性差异（P<0.01），反复力竭其它时相组的电流密度均下降，分别为0.89±0.17pA/pF、0.96±0.03pA/pF和0.92±0.29pA/pF，与对照组及一次力竭各组相比，均具有显著性差异（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。6.力竭运动对大鼠SAN细胞I_KATP电流的影响：与对照组1.02±0.07pA/pF相比，一次力竭运动可引起大鼠窦房结KATP通道I_KATP电流密度增加，但无统计学意义；反复力竭各时相组I_KATP电流密度为3.77±0.05pA/pF（P<0.01），并明显高于一次力竭O-0h组（P<0.01），但反复力竭组中随着取材时间的延长，电流密度呈下降趋势，24h内仍未达到对照组水平。研究结论：1.两周反复力竭运动可导致心脏SAN细胞I_f，I_Ca,L、I_Ca,T、I_Kr电流密度减少，I_KATP电流密度增加，上述5种离子通道出现变化的综合效应可导致窦房结自律性、兴奋性及传导性等功能活动异常，致使运动员窦性心动过缓、窦性心律失常、病态窦房结综合症等结内病理变化的发生率增加。2.长期大强度反复运动训练对于心脏窦房结起搏活动的影响可进而引发异位起搏点出现，如房性心律、心房颤动、心房扑动及室性心律失常等心脏电兴奋产生异常，还可能导致房室传导阻滞、房室分离等电兴奋传导障碍。由此可见，运动训练对于窦房结起搏活动相关离子通道电生理学的影响可能是运动性心律失常的主要发生机制之一。第二部分力竭运动对大鼠窦房结离子通道亚基mRNA及蛋白质表达的影响研究目的：探讨两周力竭运动对大鼠SAN细胞膜上HCN通道亚基HCN1、HCN2、HCN4，L-Ca²⁺通道亚基Cav1.2、Cav1.3，T-Ca²⁺通道亚基Cav3.1、Cav3.2，延迟整流K⁺通道亚基ERG、KvLQT1，ATP敏感型钾离子通道亚基Kir6.2共10个亚基mRNA和蛋白质表达的影响。实验分组及动物模型建立：同第一部分。研究方法：1.应用实时荧光定量PCR法测定各组大鼠SAN组织HCN1、HCN2、HCN4、Cav1.2、Cav1.3、Cav3.1、Cav3.2、ERG、KvLQT1、Kir6.2mRNA表达水平。2.应用Western blot法测定各组大鼠SAN组织HCN1、HCN2、HCN4、Cav1.2、Cav1.3、Cav3.1、Cav3.2、ERG、KvLQT1、Kir6.2蛋白质表达水平。3.数据统计：实验结果以均数±标准差（x±S）表示，数据采用SPSS13.0软件及EXCEL软件中单因素方差分析（ANOVA），各实验组与对照组之间的显著性差异采用SNK法，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为非常显著性差异。研究结果：1.力竭运动对大鼠SAN HCN通道亚基mRNA及蛋白质表达的影响：（1）mRNA水平：与对照组相比，一次力竭组中的O-0h组HCN1、HCN4mRNA相对表达量明显升高（P<0.05，P<0.01），O-4h组HCN1、HCN4明显升高（P<0.01，P<0.05）；反复力竭组R-0h与R-4h组HCN1明显下降（P<0.01，P<0.01）；反复力竭各组HCN2、HCN4mRNA表达明显下降（P<0.01）。（2）蛋白质水平：与对照组相比，反复力竭各组HCN1蛋白质表达无明显变化，HCN2、HCN4蛋白质表达明显下降（P<0.01）。2.力竭运动对大鼠SAN L-Ca²⁺通道亚基mRNA及蛋白质表达的影响：（1）mRNA水平：各组Cav1.2mRNA表达无明显变化；与对照组相比，O-0h、O-4h、O-12h组Cav1.3mRNA相对表达量升高（P<0.05、P<0.05、P<0.05）；反复力竭各时相组Cav1.3mRNA相对表达量下降（P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01）。（2）蛋白质水平：各组Cav1.2蛋白质表达无明显变化；与对照组及一次力竭O-0h组相比，反复力竭各时相组Cav1.3标准灰度值下降（P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01）。3.力竭运动对大鼠SAN T-Ca²⁺通道亚基mRNA及蛋白质表达的影响：（1）mRNA水平：与对照组相比，O-0h、O-4h、O-12h组Cav3.1mRNA相对表达量升高（P<0.05、P<0.05、P<0.05）；反复力竭各时相组Cav3.1mRNA相对表达量下降（P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01）；各组Cav3.2mRNA表达无明显变化。（2）蛋白质水平：与对照组及一次力竭O-0h组相比，反复力竭各时相组Cav1.3标准灰度值下降（P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01）；各组Cav3.2蛋白质表达无明显变化。4.力竭运动对大鼠SAN I_Kr通道亚基mRNA及蛋白质表达的影响:（1）mRNA水平：与对照组相比，反复力竭各时相组ERG mRNA相对表达量下降（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）。（2）蛋白质水平：与对照组及一次力竭O-0h组相比，反复力竭各时相组ERG标准灰度值下降（P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01）。5.力竭运动对大鼠SAN IKs通道亚基mRNA及蛋白质表达无影响。6.力竭运动对大鼠SAN ATP敏感型K⁺通道亚基mRNA及蛋白质表达的影：（1）mRNA水平：与对照组相比，反复力竭各时相组Kir6.2mRNA相对表达量上调（P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.05）。（2）蛋白质水平：与对照组及一次力竭O-0h组相比，反复力竭各时相组Kir6.2标准灰度值下降（P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01）。研究结论：两周反复力竭运动可引起大鼠窦房结HCN、L-Ca²⁺、T-Ca²⁺、快激活内向整流K⁺通道及ATP敏感型K⁺通道亚基mRNA及蛋白质表达的变化，长期大强度反复运动训练状态下，窦房结起搏活动相关离子通道组成亚基mRNA及蛋白质的表达与通道电流密度的变化趋势具有一致性，可见，离子通道亚基是通道电生理活动改变的主要结构因素及重要的分子学机制，因此，运动对于窦房结细胞离子通道功能状态的影响可能主要由通道亚基的改变介导。