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背景与目的:研究发现Wnt/β-catenin信号通路在脑缺血后神经元凋亡中起着保护作用,其抑制剂DKK1可抑制Wnt/β-catenin信号通路加重脑损伤。同时研究发现在细胞培养和全胚胎模型中p63(△Np63)过量表达激活Wnt/β-catenin信号通路。课题组前期研究发现p63在脑缺血后高表达,那么脑缺血后高表达的p63是否激活Wnt/β-catenin信号通路以及对脑缺血损伤发挥何种作用?为探讨此问题设计了本实验。本实验通过观察侧脑室注射p63抗体或Dkk1蛋白对大鼠脑缺血/再灌注损伤后CA1区p63蛋白、β-catenin蛋白、神经元凋亡及血清S100β蛋白水平的影响,探讨p63在大鼠脑缺血后Wnt/β-catenin信号通路中的作用,为进一步调控脑缺血缺氧后神经元凋亡,对脑缺血、脑梗塞的防治提供实验依据。方法:雄性SD大鼠84只,体重250～300g,随机等分为4组(n=21):对照组(A)、缺血组(B)、p63抗体组(C)、DKK1蛋白组(D)。A组行侧脑室注射生理盐水但不行脑缺血/再灌注处理;B、C、D组大鼠经侧脑室分别注射生理盐水、p63抗体、DKK1蛋白,然后行脑缺血/再灌注处理。脑缺血动物模型采用二血管(双侧颈总动脉)阻断加低血压(35-40mmHg)法建立大鼠脑缺血/再灌注模型,缺血时间40min。所有大鼠分别于术后24h、48h、72h行神经行为学评分,双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)检测血清S100β的水平,脑组织切片测定海马CA1区神经元密度(HE染色),神经元凋亡数(TUNEL法),免疫组化检测海马CA1区p63和β-catenin蛋白表达,并对后两种蛋白的表达水平作半定量分析。结果:1.神经行为学评分:所有大鼠术前、A组术后神经行为学评分均在正常范围(p>0.05)。B组、C组和D组大鼠在术后各时点的神经行为学评分低于术前(p<0.01),术后各个时点评分以72h最低,各时点比较依次是24h>48h>72h,差异有统计学意义(p<0.05)。各组间术后同时点神经行为学评分依次是A组>C组>B组>D组,差异有统计学意义(p<0.01)。2.神经元密度:A组大鼠术后各时点神经元密度差异无统计学意义(p>0.05)。B组、C组、D组大鼠术后24h、48h、72h神经元密度明显降低,其中72h最低,各时点比较依次是24h>48h>72h,差异有统计学意义(p<0.01)。各组间术后同时点神经元密度依次是A组>C组>B组>D组,差异有统计学意义(p<0.01)。3.神经元凋亡:A组大鼠术后各时点仅见极少量凋亡细胞,各时点间差异无统计学意义(p>0.05)。B组、C组、D组大鼠术后24h、48h、72h海马CA1区凋亡细胞数升高,其中术后48h最高,各时点比较依次是48h>24h>72h,差异有统计学意义(p<0.01)。各组间术后同时点凋亡细胞数依次是A组<C组<B组<D组,差异有统计学意义(p<0.01)。4.血清S100β水平:A组大鼠血清中S100β蛋白水平较低,各时点间差异无统计学意义(p>0.05),B组、C组、D组大鼠术后24h、48h、72h血清中S100β蛋白升高,其中术后48h最高,术后各时点血清中水平依次是48h>24h>72h,差异有统计学意义(p<0.01)。各组间术后同时点大鼠血清中S100β蛋白水平依次是A组<C组<B组<D组,差异有统计学意义(p<0.01)。5.p63和β-catenin蛋白的表达:①A组大鼠术后各时点仅见少量p63表达,差异无统计学意义(p>0.05)。B组、C组、D组大鼠术后24h、48h、72hp63表达增加,各时点比较依次是48h>72h>24h,差异有统计学意义(p<0.01)。各组间术后同时点P63表达水平,依次是A组<C组<B组<D组,差异有统计学意义(p<0.01)。②A组大鼠术后β-catenin蛋白表达较多,各时点间差异无统计学意义(p>0.05)。B组、C组、D组大鼠术后β-catenin蛋白表达降低,48h时最低,72h稍回升,术后各时点依次是24h>72h>48h,差异有统计学意义(p<0.05)。各组间术后同时点β-catenin蛋白表达水平,依次是A组>C组>B组>D组,差异有统计学意义(p<0.01)。6.相关分析:大鼠脑缺血/再灌注损伤后海马CA1区β-catenin蛋白的表达分别与p63、神经元凋亡呈负相关(相关系数分别是r=-0.941;r=-0.887)。p63表达、S100β水平与脑缺血/再灌注损伤后神经元凋亡呈正相关(相关系数分别是r= 0.956;r= 0.936)。结论:1.大鼠侧脑室注射DKK1蛋白可加重脑缺血后脑损伤,其机制可能是通过抑制脑缺血后的Wnt/β-catenin信号通路、上调p63的表达,增加神经元的凋亡有关。2.大鼠侧脑室注射p63抗体对脑缺血具有神经保护作用,其机制可能是降低脑缺血后p63的表达,上调Wnt/β-catenin信号通路,抑制神经元凋亡有关。3.大鼠脑缺血后海马CA1区β-catenin蛋白表达分别与p63表达、神经元凋亡呈负相关;p63表达、S100β水平与神经元凋亡均呈正相关。