白灵菇(Pleurotus tuoliensis),是中国具有自主知识产权及确切来源的食用真菌品种之一,它主要分布在世界上的亚洲及南欧地区。白灵菇作为一种新兴的珍稀食药用菌品种受到广大群众的喜爱。据报道,新疆是我国的最早驯化栽培的地方,例如裕民、托里、青河等地区。白灵菇的生长发育过程中的催蕾阶段是必须要经过低温和温差刺激的,故它属于中低温型变温结实食用菌,没有低温阶段则不能促使原基分化和菇蕾形成,生长发育过程的这一特质已然成为白灵菇产业化栽培发展的重要突破点。本实验旨在开展白灵菇低温胁迫处理过程中DNA甲基化调控机理的研究,为白灵菇育种提供理论依据和实验指导。本文选取低温胁迫诱导条件下不同发育时期白灵菇为实验材料,利用甲基化敏感多态性扩增(MSAP)技术研究了低温处理诱导的白灵菇基因组DNA甲基化的水平和高/低甲基化模式变化,并通过重亚硫酸氢盐高通量(Bisulfite-sequencing,BS-seq)全基因组测序技术研究DNA甲基化的基序分布和调控作用。主要研究结果如下:1.MSAP分析方法的建立利用三种方法提取白灵菇基因组,结果表明改良的CTAB法提取的基因组质量较好。通过设计单因素和正交试验,发现37℃下进行双酶切5个小时为最佳酶切时间,选择16℃连接过夜(即12 h)反应比较合适;预扩增产物选用10倍的稀释度为连接产物的稀释倍数。依据预扩增产物在1%琼脂糖凝胶呈弥散分布的原则,直观预扩增产物电泳图,同时节俭考虑最佳使用量为准,故选择预扩增PCR反应体系确定为10×PCR Buffer 2.5μL,dNTP 2.5 mmol·L~-11 1.0μL,Primer 200 ng·μL~-11 1.5μL,Taq聚合酶0.2μL,DNA模板2.0μL。2.低温胁迫诱导白灵菇不同生长发育时期DNA甲基化的变化利用优化的MSAP方法研究低温胁迫诱导白灵菇不同生长发育时期的甲基化,首先从420对引物筛选出条带数目多且清晰的100对引物,扩增产物共产生2060条带,得到结果为25℃时甲基化水平为24.3%,在4℃低温胁迫处理3天后,甲基化水平变为32.2%;菌丝扭结期,甲基化水平为最高41.4%;子实体形成后,甲基化水平降为38.7%。DNA甲基化模式分析结果为:CG和CHG甲基化位点的甲基化降低变异频率没有他们相应的甲基化升高的变异频率高;CG位点的变异频率要高于CHG位点的变异频率。3.不同低温胁迫诱导白灵菇DNA甲基化变异序列的相关基因功能分析研究发现,低温处理后体现出略高的DNA甲基化修饰,full-methylated水平一直显著高于hemi-methylated水平,full-methylated在12.62%到19.10%之间,hemi-methylated在3.84%到9.21%之间。低温刺激使CG hypermethylation产生了更大的变化,而CG hypo-变化量最少。在对相关基因的表达的分析中发现,在不同低温处理4℃(Day 3)和13℃(Day3),大部分基因都表现出显著变化,钙离子信号和渗透调节基因与低温防御蛋白相关基因表现为下调表达。4.低温胁迫诱导白灵菇全基因组重亚硫酸氢盐测序(Bisulfite-sequencing)分析白灵菇基因组CG和no-CG基序的全基因组DNA甲基化平均水平,分别为CG 54.65%、CHG 8.48%和CHH 36.86%。在白灵菇基因组的检测数据中,CG位点的甲基化水平一般处于高甲基化水平状态,CHG位点的甲基化水平则处于相对较低的状态。白灵菇低温处理后,基因组甲基化水平的基序分布为CG 47.14%、CHG 10.28%和CHH 42.58%。白灵菇中,外显子的甲基化水平比内含子甲基化水平低,整体呈现出内凹的趋势。三种基序的甲基化水平表现为CG>CHG>CHH,在染色体上的分布规律是趋于一致的。白灵菇基因组甲基化修饰水平以及甲基化修饰密度较高的区域往往都是基因密度较低的区域,也即富含转座子、微卫星序列等重复序列等的区域,但也有部分含有高密度基因的区域有较高的甲基化修饰水平。我们在白灵菇低温胁迫诱导原基形成过程检测到了大量的DMRs,在三种mCG、mCHG、mCHH甲基化修饰中虽然mCG修饰的总量最多,但属于mCHH的DMRs数量最多。