【摘 要】
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肝素和硫酸乙酰肝素是被广泛应用于临床中的抗凝血药物多糖,同时研究发现其可能在抗癌、抗病毒具有一定的作用。医药级别的肝素从家畜肠粘膜分离得到,然而从动物组织制备的肝
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肝素和硫酸乙酰肝素是被广泛应用于临床中的抗凝血药物多糖,同时研究发现其可能在抗癌、抗病毒具有一定的作用。医药级别的肝素从家畜肠粘膜分离得到,然而从动物组织制备的肝素存在潜在的污染隐患。因而,微生物来源的heparosan合成肝素及其衍生物成为研究热点。本文进行了大肠杆菌K5中尿苷二磷酸葡糖脱氢酶基因(kfiD)的克隆表达及heparosan硫酸化修饰。首先克隆得到E. coli K5产Heparosan关键酶基因kfiD,经测序和BLAST比对后,发现克隆得到的kfiD基因片段与NCBI上已报道的Escherichia coli Nissle1917, Escherichia coli ABU83972的同源性均为100%。同时经BioEdit软件分析发现kfiD基因片段编码392个氨基酸,KfiD蛋白大小约为44kDa。在成功克隆得到kfiD的基础上,构建重组表达质粒pET28b-kfiD,并将其转入E.coliBL21(DE3)中,实现了kfiD在E.coliBL21(DE3)中的表达,得到KfiD融合蛋白的分子量大小为47KDa。对kfiD在E. coli BL21(DE3)中表达的诱导条件进行优化,确定最适诱导条件：IPTG诱导剂量为0.4mmol/L、诱导时间为4h。此钱,利用DEAE琼脂糖凝胶Fast Flow对heparosan粗品进行纯化,heparosan纯化的平均得率为12.7%。利用浓硫酸法制备heparosan硫酸化衍生物,发现反应时间为30min时,heparosan硫酸化产物的硫含量最高,为3.34%,硫取代度为0.189。其后对商品化的肝素钠进行硫含量测定,发现其含硫量为18.25%,硫取代度为2.2。由此可知,若要达到商品化肝素衍生物的硫酸基取代度,需对heparosan进行进一步硫酸化修饰。分别对纯化后的heparosan, heparosan硫酸化衍生物,肝素钠进行1H NMR分析,得到heparosan硫酸化衍生物在GlcNAc (H1)位置的确有硫酸基的取代,GlcNAc (CH3)位置无硫酸基取代,而GlcA (HI)位置、GlcNAc (H2, H3, H4, H5, H6)位置或GlcA(H2,H3,H4,H5,H6)位置,有取代,但无法确定具体的取代位置。同时由heparosan硫酸化衍生物的1H-NMR可知采用浓硫酸法不会破坏heparosan双糖结构。
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