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前言:喉鳞状细胞癌是耳鼻咽喉科最常见的恶性肿瘤之一,约占头颈部恶性肿瘤的20%。在中国,尤其是东北地区,喉癌的发生率呈逐年上升趋势,其恶性程度高,且容易出现转移和复发,严重影响其治疗及预后,成为威胁患者生命健康的主要肿瘤疾病之一。目前,对于喉癌患者的诊断和治疗,仍缺乏理想的分子标志物,喉癌复发和转移分子机制的研究仍是目前肿瘤研究的重点和难点。因此,研究喉癌复发和转移的分子机制有助于发现喉癌诊治和预后判定的分子标志物,具有潜在的临床意义。加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA)算法作为一种高水平且准确的,多样本复杂数据分析工具,MYCT1是本课题组前期发现的与喉癌发生发展密切相关的基因,参与喉癌细胞增殖、迁移、凋亡等能力的调控,但其发挥功能的分子机制仍不清楚。因此,课题组构建了稳转过表达MYCT1的喉癌Hep2细胞系,并通过RNA-seq筛查了MYCT1下游差异表达基因,其中包括Collagen Ⅵ。在喉癌中,明确MYCT1调控Collagen Ⅵ的分子机制将有助于明确MYCT1调控细胞迁移的分子机制。Ⅵ型胶原(Collagen Ⅵ)是广泛分布的细胞外基质蛋白,在多种癌症中高表达,促进肿瘤的发生和发展。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是由细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子,是重要的肿瘤微环境组分,调控细胞的形态、运动及分化等,与癌细胞生长和转移密切相关。Ⅵ型胶原是一种主要的ECM蛋白,由三条主要多肽链α1(Ⅵ)、α2(Ⅵ)和α3(Ⅵ)组成,分别由不同的基因COL6A1、COL6A2和COL6A3编码。肿瘤组织中COL6A1、COL6A2和COL6A3 m RNA的表达水平以及Ⅵ型胶原蛋白的水平远高于癌旁正常组织。在本研究中,本人拟利用Limma包从GES6631,TCGA-HNSCC数据库中进行差异基因获取,并应用WGCNA方法利用进行加权网络富集分析,得到具有研究潜力的基因集;将重叠差异表达基因与MYCT1下游基因进行分析,筛选出具有研究意义的下游基因,并进行调控机制的研究。为找到潜在的喉癌发生和发展的诊断分子标志物和喉癌基因的治疗靶点的研究奠定基础。材料与方法:1、实验材料:喉鳞状细胞癌细胞系Hep-22、公开数据库:GES6631和TCGA-HNSCC3、实验方法:3.1数据获取(GEO,TCGA)3.2 R语言分析3.3 RNA测序3.4细胞培养3.5基因瞬时转染实验3.6 Real-time PCR检测3.7细胞异质粘附检测3.8细胞迁移能力检测3.9 Western blot检测3.10荧光素酶报告基因活性检测3.11统计分析结果:1、喉癌GSE6631数据库的差异表达基因为903个,富集成7个模块;TCGA-HNSCC的差异表达基因为843个,富集成9个模块。2、经相同表达趋势的两组基因模块组间两两比对,筛选出重复率最多的一对,进行列交叉比对,成功得到39个与HNSCC进展正相关的差异基因。3、MYCT1下游基因与上述结果进行比对,发现13个重叠差异表达基因,其中包括COL6A1,COL6A2,COL6A3。4、COL6A1,COL6A2,COL6A3(Collagen Ⅵ)在喉癌MYCT1过表达Hep-2细胞中表达水平较对照组显著降低(P<0.05),二者呈负向调控关系。5、MYCT1过表达喉癌Hep-2细胞的异质粘附和迁移能力显著下降(P<0.05)。6、敲减COL6A2,COL6A3喉癌Hep-2细胞的异质粘附和迁移能力显著下降(P<0.05)。7、Jaspar软件预测结果显示,在COL6A2和COL6A3的启动子区存在FOXP3结合位点,提示COL6A2和COL6A3可能是FOXP3潜在靶基因。8、荧光素酶报告基因活性检测结果显示,FOXP3可增强COL6A2,COL6A3的启动子区转录活性。9、Real-time PCR和Western blot结果显示,在FOXP3过表达的喉癌Hep-2细胞中COL6A2和COL6A3 m RNA表达水平显著升高,Collagen Ⅵ蛋白表达水平显著升高(P<0.05),二者呈正相关关系。10、FOXP3过表达喉癌Hep-2细胞的异质粘附和迁移能力显著升高(P<0.05),敲减COL6A2或COL6A3能够回复FOXP3过表达对喉癌Hep-2细胞的异质粘附和迁移能力的促进作用。11、Real-time PCR和Western blot结果显示,FOXP3在MYCT1过表达的喉癌Hep-2细胞中显著升高(P<0.05),二者呈负向调控关系。12、FOXP3过表达可回复MYCT1过表达对喉癌Hep-2细胞的异质粘附和迁移能力的抑制作用。结论:1、WGCNA通过数据库所创建的基因模块具有生物学意义,能够作为探究LSCC的分子机制并发掘潜在的生物标志物的工具。2、Collagen Ⅵ在喉癌中高表达并与MYCT1表达水平呈负向调控,促进喉癌细胞异质粘附、迁移,提示其在喉癌中发挥癌基因作用。3、FOXP3作为转录因子可与COL6A2,COL6A3启动子区结合并促进其转录活性。4、FOXP3在喉癌中高表达并与MYCT1表达水平呈负向调控,促进喉癌细胞异质粘附、迁移,提示其在喉癌中发挥癌基因作用。5、MYCT1部分通过抑制FOXP3的表达进而抑制Collagen Ⅵ的表达,抑制喉癌细胞粘附,迁移。