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黄瓜花叶病毒(Cucumbe.Mosai.Virus,CMV)能侵染包括茄科、十字花科、豆科等重要经济作物在内的1000多种单子叶和双子叶植物,是寄主最多、分布最广、对农作物危害最为严重的植物病毒之一。CMV为三分体+ssRNA病毒,主要通过突变、重组和假重组等方式进行变异和进化,使之能够不断适应新的环境和新的寄主,并且其基因组结构简单,因此CMV是研究RNA病毒在寄主上致病机制的模式病毒之一。卫星RNA(SatelliteRNA,satRNA)是一类依赖于辅助病毒(Helpe.virus)进行复制、包被和在寄主内扩散的低分子量的RNA,是寄生于病毒的亚病毒,影响辅助病毒在寄主植物上的症状表达。本研究对CMV亚组IA和亚组II间的假重组体Tsh-CM.(RNA2、RNA3)和Fny-CMV的R1、R2及R3进行人工交叉重组获得一系列人工假重组体(FIF2F3,FIF2T3,FIT2F3,FIT2T3),各个假重组体分别接种于心叶烟、本生烟以及番茄,在不同的接种时间分析各种寄主上的生物学表型,同时并采用Norther.blot分析CMV各个ORF的含量以期研究引起症状差异的原因。并以此为辅助病毒和Tsh-satRNA混合接种于心叶烟和本生烟上,分析该卫星的存在对辅助病毒症状的调控情况,并采用实时荧光定量PCR和Norther.blot分析该卫星和这些辅助病毒各基因组积累量之间的影响。
主要结果如下:四个假重组体CMV的表型在各寄主上存在差异,具体为在心叶烟上,FIF2T3致病性最严重,表现为严重矮化,黄化及丛簇;FIT2T3致病性次之,表现为矮化,局部性枯斑及丛簇;继而为FIF2F3,表现为典型花叶,缺刻及线性化叶片;FIT2F3症状最轻,仅表现为轻微花叶。在本生烟上,FIF2T3表现为严重矮化,黄化,致病性最重;F112T3表现为矮化,黄化,泡状花叶,致病性次之:FIF2F3表现为矮化,典型泡状花叶,但不引起黄化;而F1T2F3也是症状最轻,仅轻花叶,也不引起矮化黄化。在番茄合作903上,F1F2T3和F1T2T3表现为典型花叶,矮化:而F1T2F3矮化不明显,且表现为轻微花叶;F1F2F3表现为典型花叶,线性叶。通过生物学表型分析,也是F1F2T3最重,F1T2T3和F1F2F3次之,F1T2F3最轻。
Northern杂交结果显示:各假重组体病毒侵染心叶烟7天,14天,21天,28天后,F1F2F3-CMV,F1F2T3-CMV,F1T2F3-CMV和F1T2T3-CMV的基因组含量在7天时含量较高,在14天时含量最高,此后21天和28天检测到CMV基因组含量较少且呈逐渐下降趋势。F1F2F3-CMV和F1T2F3-CMV的基因组含量比F1F2T3-CMV和F1T2T3-CMV高。这与F1F2T3-CMV和F1T2T3-CMV在各寄主上致病性最为严重而F1T2F3-CMV在各寄主上症状较轻不一致,杂交结果显示其症状的轻重与CMV基因组含量无关。
电镜组织切片结果显示:Mock结构完整,内含淀粉粒较大;侵染Fny后有少量淀粉粒存在,空泡化不明显;携带Tsh-satRNA后的Fny结构和未侵染病毒的较相似,也较完整,而内含淀粉粒较未侵染病毒的更大。
各假重组体携带Tsh-satRNA后,在各寄主上症状均减轻,仅表现轻微花叶症状。对心叶烟上CMV及携带Tsh-satRNA后各ORF的荧光定量检测结果显示:各假重组体CMV1a.2a.2b,3a和cp的开放阅读框的相对量是携带Tsh-satRNA后含量的2.78-8.64倍之间。其中携带Tsh-satRNA后2.ORF相对含量减少最多,F1F2F3-CMV,F1F2T3-CMV,F1T2F3-CMV和F1T2T3-CM.2b的开放可阅读框的相对含量分别是携带Tsh-satRNA后的6.78,8.35,7.31,5.31倍。总体上F1F2F3与F1T2F3的1a,2a,2b,3a,cp的开放阅读框的相对量比F1F2T3与F1T2T3的高。Norther.blot结果同样显示,携带Tsh-satRNA后各CMV基因组含量明显减少。
总的来说,携带Tsh-satRNA后各假重组体CMV的基因组含量减少,这也是携带Tsh-satRNA后各假重组体CMV在不同寄主上症状都减轻的原因。在不携带Tsh-satRNA时,各假重组体病毒基因组含量也有差异,F1F2F3-CMV和F1T2F3-CMV的基因组含量相对于F1F2T3-CMV和F1T2T3-CMV反而高,这与F1F2T3-CMV和F1T2T3-CMV在各寄主上致病性最为严重而F1T2F3-CMV在各寄主上症状较轻不一致,所以说明F1F2T3-CMV和F1T2T3-CMV在各寄主上致病性严重和基因组含量无关。