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目的:室管膜下区(SVZ)是目前公认的成年个体神经干细胞最为集中的区域之一。SVz神经干细胞产生的祖细胞是SVZ细胞中最具特色的细胞群,它自产生起即具备发育为神经元的潜能,这使得SVZ神经干细胞成为研究神经干细胞发育的较佳模型。
本实验选用Dil荧光染料预标记大鼠SVZ的原始细胞,后制备局灶性脑缺血模型,经头穴丛刺法治疗后,观察该疗法对SVz的神经干细胞增殖、迁移、分化的影响,以及该疗法对脑缺血后FGF-2和NCAM含量的影响,探讨该疗法通过对局部微环境的调控进而促进成年神经再生,修复和重建神经网络的理论机制。
方法:
(1)各组大鼠于立体定位仪上定坐标,将 10μL0.2%的荧光染料Dil注射于体质量250-300g的雄性Wistar大鼠侧脑室以预标记室管膜下区细胞;
(2)48h后采用血管内栓线法制备大鼠局灶性脑缺血模型;
(3)Bederson神经功能评定方法评定大鼠神经功能缺损程度,评分低于2分者剔除;
(4)将造模后符合评分标准的大鼠随机分为模型组、头针组、头穴丛刺法组,每组12只,假手术组4只,各时间点分组相同;
(5)各组大鼠取材前,采用脉冲式的BrdU标记方法标记新生细胞;
(6)普通光镜观察组织病理形态学的改变;
(7)原位杂交法检测FGF-2mRNA和NCAMmRNA的表达;
(8)激光共聚焦显微镜检测预标记原始SVZ神经干细胞后,再检测双重免疫荧光染色所确定的分化的细胞。
结果:
(1)治疗前各组大鼠神经功能评分,无明显差异,治疗后头穴丛刺法组与模型组比较有极显著性差异,与头针组比较有显著性差异;
(2) 头穴丛刺法组HE染色显示,该组24小时时间点多见坏死灶边缘清晰,未见坏死过渡表现,21 天时间点多见梗死灶周围毛细血管垂直长入,神经纤维新生;
(3) 头穴丛刺疗法促进了FGF-2mRNA和NCAMmRNA在神经细胞浆、胶质细胞浆以及血管内皮的表达,与其他两组比较有显著性差异;
(4)模型组、头针组、头穴丛刺法组均可见Dil标记的室管膜下区细胞迁移至梗死周边的纹状体和皮质,并且分化成神经元或胶质细胞,头穴丛刺法组Dil/BrdU/NeuN或Dil/BrdU/GFAP标记的细胞明显增多,与其它两组比较有显著性差异;
(5)头穴丛刺法组BrdU/NeuN及BrdU/GFAP阳性细胞表达均多于其它两组,组间比较有显著性差异。
结论:
(1)头穴丛刺法促进局灶性脑缺血后大鼠神经功能康复,神经功能评分有明显改善;
(2)头穴丛刺法能使局灶脑缺血后脑组织中FGF-2mRNA及NCAMmRNA表达更高,表达时程更长;
(3)头穴丛刺法促进内源性FGF-2及NCAM合成增加可能是促进神经干细胞增殖的一个机制;
(4)头穴丛刺法能促进局灶脑缺血后脑组织神经生发中心SVZ区神经干细胞增殖,并且随时间递增减少其增殖衰减;
(5)头穴丛刺法可促进Dil标记的室管膜下区细胞均迁移至梗死周边的纹状体和皮质,并且分化成神经元或胶质细胞;
(6)头穴丛刺法能促进局灶性脑缺血后室管膜下区神经干细胞的迁移,并且数量更多,同时表达BrdU/NeuN及BrdU/GFAP(即成熟神经元及胶质细胞)的阳性细胞更多,即该法促进了内源性的神经干细胞的分化。