研究背景：长期胆汁淤积性黄疸是儿科临床常见的一类疾病,病因复杂,其鉴别诊断仍然是一个难点。婴儿胆汁淤积性黄疸最重要的原因是婴儿肝炎综合征(infant hepatitis syndrome, IHS)和先天性肝外胆管闭锁(extrahepatic biliary atresia, EHBA),占50%～70%,鉴别两者间病因并及时对症处理极为重要。肝内胆汁淤积性黄疸可由新生儿肝炎、感染性疾病、内分泌代谢异常或酶缺陷等多种病因引起,经过药物治疗或保守治疗可以治愈。另一方面,先天性肝外胆管闭锁是婴儿时期一种进行性病变,如果不及时早期手术治疗,最终会导致胆汁淤积性肝硬化、门静脉高压、肝衰竭甚至死亡。因此早期手术干预可显著改善先天性肝外胆管闭锁的结局,而一个可靠的无创性检查,鉴别诊断其胆汁淤积性黄疸病因是非常重要的。对于胆汁淤积性黄疸病因的评价,肝胆显像作为一种生理状态下的无创、实时检查方法已经广泛应用。2004年北美学会儿科胃肠学、肝病学和营养学的胆汁淤积指南委员会审议了用于评价胆汁淤积性黄疸的诊断性检查,指出“肝胆显像对胆道梗阻诊断敏感性好,是一项很好的检查方式,但是检查费时且费用较高,有一定的假阳性和假阴性；如果其他检查方式不能排除胆道梗阻,而肝胆显像在胆汁淤积性黄疸病因中的作用是非常具有潜在性价值”。本课题采用前瞻和回顾结合的方法,对2007年1月～2014年1月在南方医科大学南方医院核医学科检查的63例持续性黄疸住院患儿系统观察,进行实验室检查以及病史等方面的随访,了解婴儿期胆汁淤积性肝病的预后,探讨放射性核素肝胆显像在鉴别持续性黄疸病因中的作用,为早期诊断和及时治疗争取时间。目的：1.研究99mTc-EHIDA肝胆显像联合总胆汁酸(TBA)、谷氨酰转移酶(γ-GT)测定对临床难以鉴别的婴儿肝炎综合征(IHS)与先天性肝外胆管闭锁(EHBA)所导致的早期婴儿持续性黄疸的诊断价值。2.鉴于99mTc-EHIDA肝胆显像对临床重度胆汁淤积性黄疸应用的局限性,通过对新西兰兔胆总管结扎诱导重度肝外胆汁淤积模型,探讨99mTc-MIBI作为新的肝胆显像剂评价其对重度胆汁淤积性黄疸病因的鉴别诊断价值。3.建立肝外胆汁淤积模型和肝炎模型,观察99mTc-甲氧基异丁基异睛(99mTc-MIBI)肝胆动态显像变化特点,研究P-糖蛋白(P-gp)在大鼠肝脏、肾脏和肠组织中的表达,并探讨99mTc-MIBI肝胆动态显像与大鼠肝脏、肾脏和肠组织中P-gp的表达情况之间的相关性。材料与方法：1 99mTc-EHIDA肝胆显像联合总胆汁酸、谷氨酰转移酶检测对早期婴儿持续性黄疸的诊断价值2007年1月～2014年1月在南方医科大学南方医院核医学科检查的63例持续性黄疸入院患儿,剔除2岁以上的病例3例。60例持续性黄疸患儿,均使用单光子发射计算机断层成像仪(SPECT)进行99mTc-二乙基乙酰苯胺亚氨二醋酸(EHIDA)肝胆显像,使用AU5431全自动生化分析仪检测其血生化水平,分析99mTc-EHIDA肝胆显像及联合TBA、γ-GT检测的诊断效能。SPECT肝胆动态显像如下：视野包括肝脏和肠道,以5s/帧(采集1min),再以1 min/帧(采集4min)连续动态采集以及5min、30min、1h全腹部前、后位静态显像,若1h肠道无放射性分布,分别于3-4h、6-8h、24h行延迟显像,如肠道出现放射性则停止显像。为排除体表尿液放射性污染必要时加做侧位显像。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用两独立样本Mann-Whitney U检验以及受试者工作特征曲线(ROC)分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。299mTc-MIBI肝胆显像对重度胆汁淤积性黄疸病因的鉴别诊断价值2.1临床资料2011年6月～2014年1月在南方医科大学南方医院核医学科检查的18例重度胆汁淤积性黄疸入院患儿。纳入本组的诊断标准：1)总胆红素小于85.5μmol/L时,直接胆红素大于17.1μmol/L;或总胆红素大于85.5μmol/L,直接胆红素占总胆红素的比例大于20%；2)首日静脉注射99mTc-EHIDA,24h肠道内未见放射性分布；3)病因不明或经临床正规治疗无效。SPECT肝胆动态显像如下：首日静脉注射99mTc-EHIDA,以5s/帧(采集lmin),再以1 min/帧(采集4min)连续动态采集以及5min、30min、1h、3～4 h、6-8h、24h全腹部前、后位平面显像,若24h肠道内未见放射性分布,于次日静脉注射99mTc-MIBI显像剂,连续动态观察直至肠道内出现放射性显影,停止检查。2.2实验动物和方法2.2.1实验动物新西兰大耳兔(普通级)5只,体重平均2.5kg,购于南方医科大学实验动物中心。2.2.2胆总管结扎法诱导肝外胆汁淤积动物模型禁食12h,不禁水,用3%戊巴比妥钠按1 ml/kg体重静脉麻醉,备皮,消毒,取上腹部正中切口开腹,沿肝十二指肠韧带找到胆总管,在十二指肠上方双重结扎胆总管,术后逐层缝合并给予青霉素注射。2.2.3血生化检测术前1天、术后1、2、3、5、7天抽血,检测胆红素水平及肝功指标,1周后处死并取肝组织送检2.2.4实验动物显像2.2.4.1正常实验动物显像禁食4～6h,麻醉成功后,显像视野包括心脏及全腹部,静脉注射99mTc-EHIDA, SPECT采集动态图像,连续动态采集1h。若1h肠道无放射性分布,分别于2h、3h、4h行延迟显像。次日再静脉注射99mTc-MIBI,动态采集图像,若肠道内出现放射性显影,停止检查。2.2.4.2胆总管结扎术后显像通过新西兰兔胆总管结扎诱导肝外胆汁淤积模型,于术后第4天进行肝胆显像,显像方法同于术前显像。3P-糖蛋白在胆汁淤积大鼠模型肝、肾和肠组织中表达及临床意义的研究3.1实验动物6-8周龄SD大鼠15只,体重180-210g,饲养于南方医科大学实验动物中心。3.2建立动物胆汁淤积模型3.2.1胆总管结扎手术组胆总管结扎手术方法参见2.2.2章节。成功建立肝外胆汁淤积动物模型后,分别于术后第2、3、4周进行肝胆显像。3.2.2四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)诱导组以体积分数为40%的CCl4调和油灌胃,每周2次,每次3.0ml/kg,以食用白酒与蒸馏水的混合溶液作为饮用水,自由饮用。成功诱导胆汁淤积性肝炎动物模型后,于给药4周后进行显像。3.3实验动物显像大鼠麻醉后,静脉注射99mTc-MIBI显像,SPECT采集动态图像。若1h肠道无放射性分布,分别于2h、3h、4h行延迟显像。3.4样本采集与处理所有大鼠显像结束后分别被处死,打开腹腔,依次取肝、肾和十二指肠、空肠、回肠、结肠及盲肠,然后放入4%多聚甲醛中固定。3.4.1制备石蜡切片3.4.2 HE染色步骤和封片3.4.3免疫组织化学方法检测P-gp在SD大鼠肝、肾和肠组织中的表达结果：1 99mTc-EHIDA肝胆显像联合总胆汁酸、谷氨酰转移酶检测对早期婴儿持续性黄疸的诊断价值1.1 99mTc-EHIDA肝胆显像在EHBA组与IHS组中的比较99mTc-EHIDA显像诊断EHBA灵敏度、特异性和准确度分别为100%(17/17)、67.57%(25/37)和77.78%(42/54),而诊断IHS灵敏度、特异性和准确度分别为67.57%(25/37)、100%(17/17)和77.78%(42/54)。1.2 EHBA组与IHS组肝功指标及胆红素水平比较其中在EHBA组与IHS组间血清TBA、γ-GT含量的差异有统计学意义(U值分别为209.0和19.5,P均<0.05)；ROC曲线分析示TBA在IHS组,y-GT在EHBA组有一定的诊断价值(AUC分别为0.736,0.968)。1.3 99mTc-EHIDA肝胆显像联合血清总胆汁酸、谷氨酰转移酶诊断效能99mTc-EHIDA肝胆显像联合TBA、γ-GT分析表明,当放射性核素肝胆显像显示肠道无放射性显影,γ-GT为298U/L, TBA为98.5μmol/L时,诊断EHBA系列试验的灵敏度、特异性和准确度分别为100%(17/17)、100%(37/37)和100%(54/54)。2 99mTc-MIBI肝胆显像对重度胆汁淤积性黄疸病因的鉴别诊断价值2.1 99mTc-MIBI肝胆显像结果纳入“重度胆汁淤积”的患儿18例,其中诊断为胆道闭锁6例,男5例,女1例；婴儿肝炎综合征12例,男6例,女6例。2.2 EHBA组与IHS组肝功指标及胆红素水平比较TBIL、DBIL、IBIL、AST、ALT、ALP、LDH、TBA、γ-GT含量在EHBA组与IHS组的差异无统计学意义(P>0.05)。2.3实验动物肝功指标及胆红素水平变化术后1周,肝功指标及胆红素水平均明显高于术前,随着梗阻时间延长,血清ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL逐渐升高,术后5天左右达到峰值,然后逐渐降低,而血清ALP、γ-GT呈进行性升高趋势。2.4动物肝胆显像2.4.1正常动物肝胆显像静注99mTc-EHIDA后,15-30min胆囊、胆总管及十二指肠显影清晰,30min肠道内可见大量放射性浓聚。次日静注99mTc-MIBI后,20-30min胆囊、肠道内可见显影,随时间延长肠道内可见大量放射性浓聚。2.4.2胆总管结扎术后显像术后第4天,静注99mTc-EHIDA后,在4h内胆囊、胆总管及肠道未出现放射性显影。次日静注99mTc-MIBI后,60-75min肠道局部可见放射性显影。3P-糖蛋白在胆汁淤积大鼠模型肝、肾和肠组织中表达及临床意义的研究3.1免疫组织化学方法检测P-gp在大鼠肝、肾和肠组织中的表达P-gp在大鼠正常肝、肾和肠组织中均有分布。在正常肝脏主要分布于肝细胞间的胆小管膜上表达为弱阳性,胆总管结扎术后第2、3周时P-gp在肝细胞间胆小管膜上的表达逐渐增强,表达范围也逐渐增大,但术后第4周肝细胞受损害严重,P-gp表达在部分标本中减弱。而CCl4诱导组,阳性反应见于肝细胞和门静脉区附近,与胆总管结扎组阳性反应表达程度相似。在正常肾脏主要定位于近端小管和远端小管细胞膜,发现P-gp在肾小球及肾小球基底膜上表达阳性,胆总管结扎术后,随着梗阻时间延长,肾小球及肾小球基底膜上表达为强阳性。而CCl4诱导组,P-gp在肾脏内的近端小管和肾小球基底膜,也为强阳性表达。在正常肠组织主要分布于肠黏膜上皮细胞顶端和小肠腺腔面上皮细胞顶端,在十二指肠、空肠和回肠表现为强阳性,在结肠和盲肠表现为中度阳性,大鼠胆总管结扎术后,随着梗阻时间的延长,P-gp在十二指肠、空肠和回肠表达减弱,在结肠和盲肠表达量变化不明显。而CC14诱导组,灌胃4周与胆总管结扎术后3周二者的P-糖蛋白在大鼠十二指肠、空肠和回肠表达程度相似,但在结肠和盲肠的阳性表达反应弱于胆总管结扎组。结论：1、99mTc-EHIDA肝胆显像联合TBA、γ-GT检测可早期、无创、安全、有效地鉴别EHBA与IHS,对于早期婴儿持续性黄疸进一步治疗具有重要指导意义。2、对于临床上婴儿肝炎综合征所致的重度胆汁淤积性肝病,99mTc-MIBI显像诊断婴儿肝炎综合症的灵敏度高于99mTc-EHIDA肝胆显像,但建模动物的显像结果表明肠道对99mTc-MIBI可能具有自分泌功能,因此99mTc-MIBI显像用于重度胆汁淤积患儿的病因鉴别诊断有限。3、成功构建肝外胆汁淤积性模型和肝炎性模型,实验动物结果研究表明99mTc-MIBI的排泄与P-糖蛋白表达有关,存在着一种从血池直接排泄至肠道内的分泌方式,也表明99mTc-MIBI显像剂不能应用于重度胆汁淤积性黄疸患儿的病因鉴别诊断。