论文部分内容阅读
目的:探讨联氨基姜黄素纳米脂质体(HC-NPs)通过抑制STAT3信号通路,对肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的“再教化”作用及体内外的抗肿瘤效应。方法:将小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7(M1表型)与小鼠乳腺癌细胞株4T1共培养,以观察RAW264.7是否被“教化”为M2表型的E-RAW264.7(即TAMs),用流式细胞术(FCM)检测RAW264.7细胞表型分子表达及细胞内细胞因子水平变化,Western blot检测细胞STAT3及下游蛋白表达水平;再以“教化”后的RAW264.7细胞(E-RAW264.7)为研究对象,分PBS对照组,NPs对照组,HC-NPs处理组,刘氏染色检测细胞形态学变化,MTT检测细胞存活情况,Western blot检测细胞STAT3及下游蛋白表达水平,FCM检测细胞表型分子表达及细胞内细胞因子水平,观察HC-NPs对E-RAW264.7的“再教化”作用,使E-RAW264.7(M2型)回复M1表型的作用。将“再教化”RAW264.7与4T1细胞共培养,分PBS对照组,E-RAW264.7对照组,NPs预处理组(NPs-E-RAW264.7),HC-NPs预处理组(HC-NPs-E-RAW264.7),台盼蓝染色观察4T1细胞的死亡率,FCM检测细胞周期及细胞凋亡,Transwell小室检测细胞迁移能力及侵袭力,Western blot检测细胞STAT3及下游增殖、凋亡、侵袭相关蛋白表达水平。在6-8周BABL/c雌性小鼠近右下肢脂肪垫处移植4T1细胞及RAW264.7细胞。移植后第10天至第25天连续给药5次,3天一次,分为PBS对照组,NPs对照组,HC-NPs处理组及HC处理组。连续测量小鼠肿瘤体积大小,移植后第30天处死小鼠称量肿瘤重量,免疫组织化学(IHC)检测细胞增殖(Ki-67阳性细胞)及新生血管生成(CD31阳性微血管);TUNEL染色检测细胞凋亡,HE染色显示肿瘤细胞肺转移数目;连续观察小鼠生存期至移植后第60天,检测小鼠的存活率。结果:FCM结果显示,RAW264.7与4T1细胞共培养后,被“教化”为M2表型(IL-10high,TGF-βhigh,IL-12low),Western blot结果显示E-RAW264.7细胞p-STAT3及其下游MMP9、MMP2、VEGF蛋白表达水平升高;用HC-NPs处理E-RAW264.7细胞后,细胞形态学发生明显改变,FCM显示HC-NPs可重新回复E-RAW264.7为M1表型(IL-10low,TGF-βlow,IL-12high)。Western blot结果显示HC-NPs可明显下调E-RAW264.7细胞pSTAT3及其下游MMP9、MMP2、VEGF蛋白表达水平。经HC-NPs预处理的E-RAW264.7细胞(HC-NPs-E-RAW264.7)与4T1细胞共孵育后,不影响4T1细胞存活率和细胞凋亡,但却能显著减少S期细胞数量(P<0.05);Transwell小室迁移及侵袭实验结果显示,与对照组相比,4T1细胞与HC-NPs-E-RAW264.7细胞共培养后,4T1细胞迁移能力及侵袭力下降,与western blot检测的相应蛋白水平变化一致。体内实验显示,HC-NPs组的小鼠肿瘤生长速度及小鼠肿瘤重量明显低于对照组;生存曲线显示,HC-NPs组小鼠生存率(80%)明显高于HC组(40%);免疫组化结果显示HC-NPs处理组中Ki-67阳性的肿瘤细胞及CD-31阳性微血管密度都明显减少;TUNEL染色分析显示,与对照组相比,HC-NPs处理组的肿瘤细胞凋亡增加;对肺组织切片进行的肿瘤细胞计数结果显示,HC-NPs显著降低了肿瘤细胞肺转移数目。结论:HC-NPs能通过抑制STAT3信号途径,使肿瘤微环境“教化“后的巨噬细胞发生型别“再教化”,此类巨噬细胞在体外与4T1小鼠乳腺癌细胞共培养后,表现为对肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭及血管生成等方面的抑制作用。另外,HC-NPs在体内实验中表现出显著的抗肿瘤作用,且与HC相比,延长了小鼠的生存时间,减低了毒副作用,因此HC-NPs具有良好的应用前景。