HCV属黄病毒科，为单股、正链、RNA包膜病毒，含大约9600个核苷酸。HCV基因组由位于5’端和3’端的两个非编码区(Untranslated region, UTR/Non-translated region, NTR)和一个大的开放读码框(Open reading frame, ORF)组成。ORF编码一个约含有3000个氨基酸的前体蛋白，在病毒和宿主细胞的水解酶作用下，形成10个病毒蛋白，5’端为结构蛋白，依次为核心蛋白(C)、包膜蛋白(E1)和(E2)，3’是端非结构蛋白，依次为P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。 HCV是引起慢性肝脏疾病的主要原因之一，HCV感染后约70％转化为慢性，并与肝硬化、肝衰竭和肝癌的发生密切相关。全世界约有1.7亿HCV感染者，是HIV-1感染者的5倍。合并HCV感染的HIV感染者并发症的发生率明显增加。由于缺乏HCV体外感染的传代细胞模型，限制了对HCV发病机理的研究，HCV如何感染靶细胞及其肝细胞嗜性，参与HCV识别、粘附、进入肝细胞的表面分子还不完全清楚。HCV的包膜糖蛋白E1／E2可能通过与靶细胞表面的受体结合，诱导E1和E2糖蛋白的构型发生变化，导致病毒与细胞膜发生融合，介导病毒颗粒内化形成包内体，感染靶细胞。 病毒与细胞表面相应受体的结合是病毒感染复制过程中的始第四军医大学协d匕学位论文动环节，是决定病毒的宿主特异性、组织嗜性及致病性的主要因素之一，因此，HCV受体的研究有助于阐明HCV致病机制。为进一步探索受体介导HCV感染的机理和寻找抗病毒治疗提供新的思路和理论依据。 己有的研究表明，HCV的EZ糖蛋白能够与细胞表面的B族I型清道夫受体(SR一Bl)结合，推测并初步鉴定SR一Bl可能是HCV致病毒株的受体之一。为探讨人SR一BI在HCV入胞中的作用，本研究进行了如下工作: 1.HCV包膜蛋白的原核表达及蛋白纯化 利用PCR方法从含HCV的ORF基因的真核质粒中扩增出Hcv的EZ及EIEZ基因，应用TA克隆将其插入pGEM一Teasy载体中，采用酶切和PCR鉴定，选取初筛正确的克隆进行测序，与公布的HCV的基因序列比较无突变。将正确的基因序列插入原核表达载体pET28(a)，转化大肠杆菌，IpTG诱导表达，Ni一NTA琼脂糖吸附柱纯化表达蛋白。ELISA、Wstem blot检测结果显示原核表达蛋白具有一定的生物学活性‘。这为进一步制备抗HCV包膜蛋白抗体及真核表达载体的构建奠定了分子生物学实验基础。 2.制备抗HCV包膜蛋白多抗血清 原核表达的包膜糖蛋白免疫新西兰兔，获得多抗血清，ELISA、western blot检测多抗血清的效价及活性，结果显示，血清在卜1280稀释后，仍然具有抗原结合活性。多抗血清为进一步研究包膜蛋白与受体的相互作用提供了有效的工具。 3.HCV包膜蛋白的真核表达及蛋白纯化 将PCR方法扩增的EZ及EIEZ基因插入含有人lgG一Fc段hC Yl亚单位的载体pBlueseript 11 SK(+)一hC YI内，获得EZ及E IE2与hC Yl的融合基因，将融合基因正向插入真核表达载体pEFBosneo。酶切鉴定正确的含有融合基因的真核表达载体转染COS一7细胞，RT.PCR检测证实，HCV包膜糖蛋白基因与hC丫1基因在RNA水平第四军医大学傅士学位论文正确拼接。免疫荧光、Wstern blot检测到包膜蛋白在COS一7细胞内的表达、夹心法ELISA证实细胞培养上清中同样有融合蛋白的分泌，收集细胞培养上清，Protein A sepharose 4 Fast Flow纯化融合蛋白，使用两种融合蛋白检测HCV阳性血清中的抗HCV包膜抗体，结果显示，抗EIEZ及EZ抗体阳性率分别达到80%和87.5%。证明纯化蛋白具有相应的生物学功能，两种融合蛋白的表达为研究HCV包膜糖蛋白的功能、筛选HCV的受体以及HCV与受体的相互作用奠定了基础。 4.建立稳定表达人SR一B1的转基因细胞株 重建受体系统是受体鉴定中的关键步骤，建立能够稳定表达人SR一B工的转基因细胞株是HCV相关的受体系统重建的中心环节。本研究将表达人sR一BI真核表达载体PcDNA3huSR一BI转染至HCV非易感的CHO细胞中进行瞬时表达，继而以G418选择性培养基进行稳定转染克隆的筛选;采用IFA、FCM、生物合成标记一免疫沉淀及Western blot等方法，对外源基因的表达进行检测，并确证表达产物的免疫反应性。结果显示.人SR一BI基因在CHO中有高效表达，而pcDNA3转染组则未见有效的表达。从而为进一步研究SR一BI能否特异性地介导HCV入胞奠定了细胞生物学实验基础。 5.SR一Bl介导HCV包膜蛋白及HCV入胞的研究 纯化的融合蛋白与稳定表达人SR一BI的细胞CHO一SR一Bl共同孵育后，直接或经过酸处理后检测包膜蛋白与细胞的结合及其入胞作用，用Anti一SR一Bl多克隆抗体与CHO一SR一Bl或Anti一EIEZ多克隆抗血清与融合蛋白孵育后，进行结合与内化实验，观察二者特异性抗体对二者结合的阻断作用。结果显示HCV的胞膜蛋白能够与CHO一SR一Bl结合并进入细胞，融合蛋白与SR一Bl共同定位在胞膜和胞浆，抗SR一Bl和EIEZ抗体能够阻断二者的结合。将含高滴度HCV一RNA的血清与CHO一SR一Bl共同孵育后，直接或经过酸处理后检测HCV颗粒与细胞的结合及其入胞情况。应用HCV链第四军医大学博创卜学位论文特异性RT一PCR(straid一speeifieRT