第一部分：人非小细胞肺癌获得性TRAIL耐药细胞株H460-R的构建目的：构建获得性TRAIL耐药的人非小细胞肺癌细胞株H460-R,并验证该耐药模型构建成功。检测外源性凋亡通路中死亡受体及诱骗受体的变化,并检测凋亡通路中相关蛋白的表达量,以明确获得性耐药过程中凋亡通路相关信号分子的改变。方法：通过特定浓度的TRAIL选择性杀伤H460敏感细胞,而后由低浓度逐渐诱导至高浓度,最终以低于IC50值的浓度培养,维持细胞的耐药性。通过乳酸脱氢酶法(LDH)检测亲本株与耐药株对TRAIL的细胞药物毒性反应。流式细胞术检测凋亡水平的改变。通过RT-PCR检测死亡受体DR4、DR5,诱骗受体DcR1、DcR2的基因表达水平。通过Western blot检测死亡受体DR4、DR5,诱骗受体DcR1、DcR2,死亡诱导信号复合体中相关蛋白FADD、cFLIP、caspase8的表达,以及检测凋亡下游效应蛋白caspase3的表达,并检测了Ⅰ型信号复合体中凋亡相关蛋白TRADD、TRAF2的表达。结果：获得性耐药细胞株H460-R的药物半数抑制浓度较亲本株明显升高(P<0.05)。流式细胞术结果显示给予相同浓度的TRAIL处理后,与H460细胞相比,H460-R细胞凋亡率显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。然而,亲本株和耐药株之间死亡受体DR4、DR5,诱骗受体DcR1、DcR2的基因表达水平及蛋白表达水平均未见明显差异(P>0.05)。死亡诱导信号复合体(DISC)中相关蛋白的表达,FADD、caspase8等在亲本株与耐药株之间无明显差异(P>0.05)。caspase8家族中凋亡下游效应蛋白caspase3的表达在两株细胞之间无明显差异(P>0.05)。在耐药细胞株中凋亡拮抗因子cFLIP的表达较亲本株明显增加(P<0.05)。Ⅰ型复合体中TRADD、TRAF2的表达均无明显变化(P>0.05)结论：成功构建人非小细胞肺癌获得性TRAIL耐药细胞株,命名为H460-R。验证了耐药株对TRAIL的敏感性降低。在亲本细胞与耐药细胞中,死亡受体DR4、DR5的基因及蛋白表达水平均无差异,诱骗受体DcR1、Dc12的基因及蛋白表达水平均无差异。提示在构建获得性耐药细胞株的过程中,并未引起受体总体表达水平的改变,为下一步研究TRAIL耐药机制奠定了重要的基础。在DISC中相关蛋白的表达检测中,我们发现,FADD及caspase8表达无差异。在耐药细胞中,cFLIP的表达量较亲本细胞中明显增加,可能是其耐药的重要原因,这为后续研究耐药相关机制以及寻找增敏途径提供了方向。Ⅰ型复合体中拮抗凋亡的重要的蛋白TRADD、TRAF2的表达未见明显变化,这两种蛋白主要在NF-κB信号的激活中发挥重要作用,提示在获得性耐药中该通路无明显改变,为后续实验研究做好基础准备。第二部分：放射线逆转获得性TRAIL耐药的相关研究目的：利用放射线照射获得性耐药细胞株H460-R,探讨放射线对逆转获得性TRAIL耐药的作用及机制。初步分析亲本株与耐药株放射生物学行为的变化,并明确在放射线处理后,凋亡相关的重要蛋白表达量以及相互作用的改变。方法：2Gy放射线照射获得性耐药细胞株H460-R后,通过乳酸脱氢酶(LDH)法检测对TRAIL的细胞毒性变化。通过流式细胞术检测凋亡率的变化。RT-PCR检测放射线处理前后死亡受体DR4、DR5及诱骗受体DcR1、DcR2的基因表达量。Western blot法检测死亡受体、诱骗受体的蛋白表达。并检测凋亡通路的下游相关蛋白的表达量的变化。细胞放射生物学方面,通过流式细胞术检测亲本株与耐药株放射线处理前后细胞周期的变化。并通过克隆形成实验检测两株细胞的放射敏感性。分别构建携带FADD、cFLIPL基因的重组表达质粒pCMV-C-HA-FADD、PCMV-C-Tag2C-Flag-cFLIPL。上述质粒转染人胎肾HEK293T细胞,经Western blot检测验证FADD、cFLIPL过表达效果。收集转染过表达质粒的HEK293T细胞,提取蛋白,经免疫共沉淀(co-IP)检测FADD与cFLIPL之间存在相互作用；接下来检测亲本株与耐药株在相同浓度的TRAIL处理后,FADD与cFLIPL之间的相互作用；最后检测耐药细胞株H460-R在放射线处理前后FADD与cFLIPL之间相互作用的变化。结果：经2Gy X线照射后,H460-R细胞株对TRAIL的毒性反应较未处理组明显增加。由结果可知,TRAIL联合射线后能显著增加获得性耐药细胞株对TRAIL的敏感性(P<0.05)。流式细胞检测凋亡的结果提示放射线联合TRAIL后,获得性耐药细胞株的早期凋亡率增加,与单纯给予TRAIL组及单纯放射线组比较,其凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)。凋亡相关蛋白表达量检测结果表明：放射线能够使H460-R对’TRAIL敏感性增加,这种增敏作用并不是由放射线直接诱导的细胞凋亡。细胞周期检测结果中,我们发现,两株细胞的周期分布比例无明显差异,我们给予放射线处理后再次检测结果提示：两株细胞的细胞周期中G2/M比例同时增高,其差异无统计学意义(P>0.05)。克隆形成实验结果显示两株细胞的放射敏感性无明显差异。我们成功构建了真核表达载体pCMV-C-HA-FADD, pCMV-C-Tag2C-Flag-cFLIPL重组表达质粒,经DNA测序验证正确后,转染人胚胎肾细胞HEK293T,经Western blot验证FADD、cFLIPL较对照组表达显著增加(P<0.05)。免疫共沉淀检测发现FADD与cFLIPL之间存在相互作用。分别检测了亲本株与耐药株中两者FADD与cFLIPL的相互作用。结果显示：相同浓度的TRAIL处理细胞后,利用免疫共沉淀检测,在亲本细胞株中未见两者相互作用,而耐药细胞株H460-R中则存在着两者的相互作用。在获得性耐药细胞株给予2GyX线预处理前后,再次检测FADD与cFLIPL之间的相互作用,双向免疫共沉淀结果提示,放射线使两者之间的相互作用减弱或者消失。死亡诱导信号复合体中,caspase8的活化的片段P43/41的表达在放射线联合TRAIL处理后较单纯TRAIL组、单纯射线组及阴性对照组高(P<0.05)。结论：放射线能够增加获得性耐药细胞H460-R对TRAIL的敏感性,但不改变细胞的死亡受体的总体表达量。亲本株与耐药株的细胞周期分布比例无明显差异,放射线处理后两株细胞的周期分布也无明显差异,提示TRAIL并未改变细胞周期的分布。克隆形成结果提示耐药株与亲本株的放射敏感性无差异,耐药株H460-R仍然是放射敏感细胞。在获得性耐药细胞株H460-R中FADD的表达与H460无差异,而cFLIPL的表达较亲本株增加,从而使获得性耐药细胞株中FADD被cFLIPL竞争性结合,无法活化caspase8,进而使凋亡信号无法向下传递。放射线能在一定程度逆转耐药细胞株H460-R对TRAIL的耐药性,其作用机制可能与放射线处理后蛋白FADD与cFLIPL之间相互作用发生改变相关。凋亡通路下游相关蛋白表达量的改变,进一步说明放射线能够一定程度上逆转TRAIL耐药,从而引起下游凋亡的发生。第三部分：放射线改变死亡受体状态对TRAIL敏感性影响的相关研究目的：探讨人非小细胞肺癌获得性耐药细胞株H460-R经放射线处理后,细胞膜表面死亡受体定位、表达量的变化以及相关功能的改变,初步探讨放射线逆转TRAIL耐药的相关机制。方法：获得性耐药细胞株H460-R经2GyX线预处理后,通过间接免疫荧光法分别标记细胞内死亡受体DR4、DR5,使用激光共聚焦检测其在细胞内的定位。通过死亡受体与高尔基体荧光双标记的方法,检测两者的细胞内定位。流式细胞术检测死亡受体细胞膜表面的表达量。利用western blot法检测放射线处理后不同时间点细胞膜表面死亡受体的表达量。通过O-糖苷酶的酶切水解蛋白后,行western blot法检测死亡受体DR5糖基化蛋白的变化。结果：免疫荧光法标记死亡受体DR4、DR5后,激光共聚焦检测结果发现,在耐药细胞株H460-R中,死亡受体DR4、DR5均匀分布于细胞浆中,放射线预处理细胞3小时后再次行免疫荧光标记,激光共聚焦检测发现死亡受体大量定位于细胞膜。而放射线处理6小时后细胞膜表面死亡受体较3小时表达量降低。我们通过流式细胞术检测细胞膜表面死亡受体的表达,与共聚焦结果一致,放射线处理组死亡受体的表达量与单纯TRAIL组、单纯射线组以及阴性对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。在细胞膜表面蛋白定量检测结果中,我们发现,放射线处理3小时后,细胞膜表面死亡受体DR4、DR5的表达量均较单纯TRAIL组、单纯射线组增加,其差异有统计学意义(P<0.05)。共聚焦检测结果中还显示：在H460-R细胞中,放射线处理后死亡受体DR5形成了浓聚。结合细胞超微结构分析,我们再次进行了死亡受体DR5与高尔基体免疫荧光双标。激光共聚焦检测结果显示：死亡受体DR5在放射线预处理后一定时间内,定位于高尔基体,而DR4无此现象。随后我们通过糖苷酶水解蛋白后,检测死亡受体DR5的蛋白表达,发现死亡受体DR5在放射线处理后,发生了O-糖基化。结论：放射线能够瞬时增加获得性耐药细胞株H460-R细胞膜表面死亡受体DR4、DR5表达,从而增加该细胞株对TRAIL的敏感性。在免疫荧光检测结果中,我们发现,放射线处理细胞后,死亡受体DR5在细胞内核旁浓聚,根据细胞器分布,我们推测该部位可能在高尔基体或者内质网。免疫荧光标记DR5与高尔基体narker Giantin后,我们发现,放射线能够诱导细胞内死亡受体DR5在高尔基体定位。结合细胞器功能我们分析,死亡受体DR5在高尔基体上完成蛋白质的糖基化修饰,我们通过O-糖苷酶水解后的蛋白检测结果证实了DR5的O-糖基化修饰。而死亡受体的糖基化能够增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性。由此我们推断,糖基化后的死亡受体DR5能够增加H460-R对TRAIL的敏感性,从而逆转获得性TRAIL耐药,是放射线增加获得性耐药细胞株H460-R对TRAIL敏感性的重要原因。