研究背景和目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,是危害女性健康的重要疾病[1]。三阴乳腺癌是指乳腺癌细胞表面受体表现为雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人表皮生长因子受体2(HER-2)均阴性的乳腺癌。该型乳腺癌多见于绝经前的年轻患者,因其对化、放疗敏感性差,易早期发生内脏转移、脑转移,5年生存率不到15%[2]。三阴乳腺癌目前尚缺少有效的治疗方法,是肿瘤研究领域亟需解决的难题之一[3]。由基因PTPN11所编码的Shp2(The Src homology phosphotyrosin phosphatase2,含Src同源区2蛋白质酪氨酸磷酸酶)分子是蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员之一,这也是第一个被确定为人类原癌基因的磷酸酶[4]。Shp2是一种特殊的酪氨酸磷酸酶,相比其它多种磷酸酶通过去磷酸化抑制信号转导的负性调控作用而言,Shp2分子的异常活化参与了细胞内外多种细胞生长因子和激素产生的信号放大反应,从而正向调控与细胞存活和增殖相关的信号转导通路[5]。既往研究表明,肿瘤中含有少量具有无限增殖潜能和自我更新能力、并驱动肿瘤形成和生长的细胞,即CSC(Cancer Stem Cell,肿瘤干细胞)或者TIC(Tumor Initiating Cell,肿瘤起始细胞)[6]。而这也是导致肿瘤细胞治疗抵抗及复发转移的根源所在[7]。因此对肿瘤干细胞进行进一步探索和研究,可能成为从根本上改变肿瘤治疗可行的方式,也可为肿瘤的治疗提供有效的靶点和治疗策略。三阴乳腺癌患者化疗敏感性差、复发转移率高,预后极差。寻找其复发和耐药的生物标志物和治疗靶点是当前三阴乳腺癌研究的热点。本研究拟利用多种经典的分子生物学和细胞生物学技术深入研究Shp2对三阴乳腺癌干性表型的调控及其临床意义。从Shp2对三阴乳腺癌的干性调控入手,揭示其与乳腺癌干细胞的关系,并在细胞学体外实验探讨Shp2与三阴乳腺癌对化疗药物5-Fu化疗抵抗的关系。同时利用乳腺癌组织芯片样本进行验证,并系统分析Shp2与三阴乳腺癌临床特征及预后的关系,探明Shp2作为三阴乳腺癌预后标志物的价值,揭示Shp2在三阴乳腺癌临床预后指导中的价值。本研究结果可望为三阴乳腺癌患者的诊疗提供新的分子靶标。方法:1.构建针对Shp2基因的干扰表达载体shRNA-shp2和阴性对照干扰表达载体sh RNA-PC3.1,并用脂质体转染法瞬时转染MDA-MB-231细胞,转染24h后观察细胞形态及转染效率。2.采用Western blot及Real-time PCR检测Shp2在RNA水平及蛋白水平上的变化情况。3.划痕实验和Transwell迁移实验检测三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的修复迁移能力、Matrigel-transwell小室侵袭实验检测乳腺癌细胞侵袭能力、流式细胞术检测细胞凋亡实验探索Shp2对化疗耐药等恶性生物学行为。4.采用Spheroid成球实验体外培养肿瘤干细胞、Real-time PCR检测在下调Shp2表达的条件下,肿瘤干细胞表型标记物的变化,从而进一步探讨Shp2是否通过调控三阴乳腺癌干细胞来影响三阴乳腺癌复发转移及化疗耐药等恶性生物学行为。5.购买乳腺癌及癌旁组织的集成化组织芯片,并进行Shp2的免疫组织化学染色,结合组织标本的临床预后资料,分析Shp2分子在乳腺癌尤其是三阴乳腺癌中的表达情况,并采用SPSS18.0软件进行预后分析。结果:1.在三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231中成功转染并诱导Shp2基因表达下调。2.通过划痕实验、Transwell、侵袭实验等细胞体外实验的方法发现,干扰Shp2表达后三阴乳腺癌细胞系修复、迁移和体外转移侵袭能力明显减弱。3.通过Spheroid形成实验、化疗抵抗实验发现在三阴乳腺癌细胞系中干扰Shp2表达后乳腺癌干细胞自我更新能力明显减弱。4.利用常规化疗药物5-Fu处理干扰表达Shp2的三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231及其对照细胞,应用PI/Annexinⅴ双染法染色,利用流式细胞检测的方法检测细胞凋亡情况,结果发现Shp2表达下调可以影响三阴乳腺癌化疗敏感性,诱导细胞发生化疗相关性凋亡。5.通过对带有详细病理资料和预后情况的三阴乳腺癌组织芯片进行Shp2的免疫组化染色实验并评分,统计分析得出乳腺癌中Shp2表达越高,患者总体生存期和无瘤生存期越差。结论:本课题研究发现Shp2促进了三阴乳腺癌的干性调控且其表达水平与三阴乳腺癌患者临床预后密切相关。实验结果显示三阴乳腺癌组织中Shp2表达显著升高。临床病理分析提示,Shp2高表达预示着乳腺癌的预后不良。体外实验显示Shp2可能参与了三阴乳腺癌化疗抵抗和自我更新能力;进一步的实验结果还提示我们干扰Shp2可增强5-Fu的化疗效果。综上所述,Shp2在三阴乳腺癌的干性调控过程中起到了重要的作用,可能是三阴乳腺癌不良预后的诊断标志物和潜在的临床治疗靶点。