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从全世界发病率来看,乳腺癌已经成为危害女性健康最常见的恶性肿瘤之一。依据世界癌症统计学预计,在2012年中估计有170万的新病例被确诊为乳腺癌,占女性全部癌症病例的25%,其中有521,900的患者死亡,占女性癌症死亡总数的15%。目前,乳腺癌虽然通过手术、放化疗、内分泌治疗以及靶向治疗等综合治疗大大提高了乳腺癌患者的生存率,但是最终还是会引起癌细胞的转移。根据研究表明,乳腺癌在治疗后的第一个3年,大约有10–15%的患者会发生远处转移。因此探究乳腺癌侵袭转移机制已成燃眉之急。Circular RNA（CircRNAs）,一种新颖的、长的、内源性非编码RNA分子,介导转录和转录后基因表达的调控。CircRNAs普遍存在于各类真核细胞的细胞质中,其结构相对稳定且序列高度保守。最近研究发现,circRNAs大量富集miRNAs结合位点,可以通过竞争性海绵、结合miRNAs,抑制miRNAs的活性,从而解除其对靶基因的调控,进而介导细胞的生物学功能。目前,circRNA已经成为研究中的热点,但是circRNA在乳腺肿瘤中的侵袭调控机制尚不清楚,因此本实验主要研究circRNA与乳腺癌之间的关系。第一章应用微阵列芯片技术筛选出乳腺癌细胞中差异表达的circRNAs研究目的:应用微阵列芯片技术筛选出乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中差异表达的circRNAs,进一步挑选出差异较大的circRNA,并完成相关特性验证,为后续相关功能及机制研究奠定基石。研究方法:我们以乳腺癌高侵袭性细胞（MDA-MB-231）和低侵袭性细胞（MCF-7）为基本,采用微阵列芯片对细胞进行了circRNA表达谱的初筛;按照circBase网站检索并获得circRNA的序列,依据引物背靠背设计原则设计circRNA的特异性引物;提取MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞总RNA,经RNase R消化后,利用实时定量PCR（RT-qPCR）进一步验证circRNA在乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中的表达差异水平,从中筛选出一个差异较大的circRNA;由琼脂糖凝胶电泳实验鉴定circRNA成环;Sanger测序实验验证circRNA的反向剪切位点;荧光原位杂交（FISH）实验鉴定circRNA在细胞中的定位。研究结果:通过对MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞的微阵列芯片分析,发现共有5842个circRNAs差异性表达（倍数差异≥4.0,p<0.05）。我们以MCF-7细胞中的circRNAs表达水平为基准,在MDA-MB-231细胞中有2598个circRNAs上调,3244个circRNAs下调,然后我们对差异倍数较大的circRNAs进行实时定量PCR验证,并从中筛选出环状RNA hsacirc0052112;通过琼脂糖凝胶电泳,发现cDNA为模板的实时定量PCR产物可以扩增出hsacirc0052112连接处的DNA片段,而以gDNA为模板则未显示目的条带,证实所设计的背靠背引物能特异性扩增hsacirc0052112。通过Sanger测序证实了hsacirc0052112的反向剪切位点,与circBase中的结果一致。通过FISH实验发现hsacirc0052112主要位于细胞质中。研究结论:基于微阵列芯片,筛选出大量差异表达的circRNAs,它们可能与乳腺癌的侵袭迁移密切相关。同时我们发现hsacirc0052112在MDA-MB-231细胞中的表达显著上调,提示其可能是潜在的促癌因子。第二章Hsacirc0052112通过海绵mi R-125a-5p调控乳腺癌细胞的迁移和侵袭研究目的:第一部分研究证实hsacirc0052112在MDA-MB-231细胞中显著上调,且hsacirc0052112主要位于细胞质中,同时我们通过生物信息学软件预测了hsacirc0052112可能结合的mi RNAs,因此我们进一步研究hsacirc0052112/mi RNA的关系,阐明hsacirc0052112调控乳腺癌迁移和侵袭的机制。研究方法:构建circ RNA过表达质粒,并利用Sanger测序验证过表达序列,然后采用电转染法将过表达质粒及对照转染进入MCF-7细胞中,将hsacirc0052112抑制物及对照转染MDA-MB-231细胞,转染成功后通过划痕实验、transwell实验检测细胞迁移和侵袭行为;利用mi Randa（August 2010 release）和RNAhybrid（version 2.1.2）两个数据库预测hsacirc0052112可以结合的mi RNAs;Target Scan、Pic Tar、Micro Cosm和mi RDB四个数据库预测hsami RNA-125a-5p的靶基因,并建立circ RNA-mi RNA-m RNA相互作用网络;构建hsacirc0052112的野生型和突变型序列并验证其序列;双荧光素酶报告系统验证hsacirc0052112靶向mi R-125a-5p;将mi R-125a-5p mimic及对照电转染MDA-MB-231细胞,转染成功后通过实时定量PCR检测hsacirc0052112的表达水平;将mi R-125a-5p mimic、mi R-125a-5p mimic+hsacirc0052112过表达质粒的混合物及对照电转染MDA-MB-231细胞,通过transwell实验检测细胞的迁移和侵袭行为;通过Western Blot实验研究mi R-125a-5p与MMP11的关系;下载并分析肿瘤基因组图谱（TCGA,http://cancergenome.nih.go）数据库中乳腺癌患者的组织样本mi RNA-Seq/RNA-Seq（HTSeq-Counts）数据和临床资料,进行相应的生物信息学分析。研究结果:划痕及transwell实验显示hsacirc0052112上调增加了MCF-7细胞的迁移及侵袭能力,而hsacirc0052112下调抑制了MDA-MB-231细胞的侵袭及迁移。通过mi Randa和RNAhybrid两个数据库预测分析,发现hsacirc0052112可以与39 mi RNAs相互结合,而且通过Target Scan、Pic Tar、Micro Cosm和mi RDB四个数据库共预测了3722个可与hsami RNA-125a-5p结合的靶基因,其中51个靶基因可以被以上三个软件同时预测。通过双荧光素酶实验发现hsacirc0052112靶向结合mi R-125a-5p,但将mi R-125a-5p mimic转染MDA-MB-231细胞后,发现hsacirc0052112的表达水平并没有明显的变化。通过transwell实验我们发现mi R-125a-5p显著抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭,但是将mi R-125a-5p mimic和hsacirc0052112过表达质粒共转染后,这种抑制作用却被减弱。通过实时定量PCR和蛋白免疫印迹实验发现mi R-125a-5p抑制MMP11的表达,但将mi R-125a-5p mimic和hsacirc0052112过表达质粒共转染后,发现抑制MMP11的作用被部分阻碍了。随后对TCGA数据库进行相关解析,发现mi R-125a-5p在乳腺癌组织中的表达显著降低,但miR-125a-5p高表达或低表达对乳腺癌患者的总生存率（OS）并无显著差异。而MMP11在乳腺癌组织中的表达显著上调,且通过Kaplan–Meier plotter生存分析发现MMP11的高表达与乳腺癌患者较差的无复发生存率（RFS）和无病生存率（DFS）有关。研究结论:Hsacirc0052112通过海绵mi R-125a-5p,增加了MMP11的表达,从而促进了乳腺癌细胞的迁移和侵袭。第三章初步探索hsacirc0052112与亲本基因ZNF83的关系研究目的:Hsacirc0052112是由ZNF83基因的第3和4外显子环化形成的,因此进一步探究hsacirc0052112是否能够影响亲本基因ZNF83的表达。研究方法:实时定量PCR检测ZNF83在MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中的表达量;将hsacirc0052112过表达质粒及空质粒转染MCF-7细胞,实时定量PCR检测ZNF83的表达量;选取并下载肿瘤基因组图谱（TCGA）数据库中乳腺癌患者的RNA-Seq（HTSeq-Counts）数据,进行相应的生物信息学分析。研究结果:在MDA-MB-231细胞中,ZNF83的表达量比在MCF-7细胞中要高;与转染空质粒的MCF-7相比,转染hsacirc0052112过表达质粒的MCF-7细胞中的ZNF83的表达量显著增加。ZNF83在乳腺癌组织中的表达显著上调,且Kaplan–Meier plotter生存分析发现ZNF83的高表达与乳腺癌患者较差的无复发生存率（RFS）密切相关。研究结论:Hsacirc0052112过表达促进了亲本基因ZNF83的表达。