产黄青霉（Penicillium chrysogenum）属于丝状真菌一类，是一种广泛存在于自然界中的霉菌，是β-内酰胺类抗生素青霉素的产生菌株，从上世纪六十年代开始对产黄青霉的研究，在以前人们对产黄青霉的研究目的只是为了提高青霉素的产量，人们利用物理诱变和化学诱变等方法对产黄青霉进行诱变育种，然后通过做大量的筛选工作来获得高产菌株。　　产黄青霉菌种选育一般常用的策略是非理性策略，其中包括随机策略和半理性策略。随着人们对分子生物学和代谢工程进一步的了解，对产黄青霉的研究由细胞水平进入分子水平，了解了青霉素的代谢途径以及所涉及到的各个控制基因，因此菌种选育工作由非理性策略转向理性策略。由于丝状真菌中非同源重组效率高于同源重组效率，在基因定点敲入时常需较长的同源臂(4-7kb)，使得该丝状真菌的基因工程研究难度较大。本研究期望通过基因工程技术手段，敲除非同源重组复合体中的关键蛋白Ku70的编码基因，构建无痕敲除ku70的底盘细胞;另外，通过非理性策略---等离子诱变方法筛选青霉素高产菌株。研究结果如下:　　1)本文利用RT-PCR方法获得来源于顶头孢霉（cephalosporium acremonium）的大小分别为1158bp、1830bp、1152bp、999bp的cefG(编码DAC乙酰转移酶，DAC-AT)、cefD1（异青霉素N-乙酰COA合成酶）、cefD2（异青霉素N-乙酰COA异构酶）、cefEF（编码脱乙酰氧头孢菌素C合成酶-羟化酶）基因。　　利用无模板PCR技术合成单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidinekinase; HSV-TK）基因，第一步利用TPCR技术将寡核苷酸链连接在一起，第二步利用FPCR方法将小片段DNA连接在一起，第三步是HSV-TK基因的转化和验证。　　2)利用PCR从产黄青霉上基因组上扩增KU70上下游同源臂和pcbAB-pcbC基因间双向启动子，大小分别为1586 bp、1000bp、1015 bp;从构巢曲霉上（cephalosporium acremonium）扩增608 bp的TrpCTer基因;分别从pET-gfp和pCAMBIA-ble质粒上扩增720bp的gfp基因和712bp的ble及其终止子序列。　　利用酵母同源重组方法，将ku70上下游同源臂、pcbAB-pcbC、TrpCTer、 gfp、ble和载体质粒在重组酶的作用下组装成大小为5641 bp的用于产黄青霉无痕敲除的片段。　　3)通过对原生质体的制备和再生因素的研究，确定菌龄48h为最适宜，纤维素酶和蜗牛酶体积比为3∶2，酶解时间为4h。　　通过PEG-CaCl2介导的转化技术将ku70质粒转化到产黄青霉体内，通过同源重组整合到产黄青霉基因组上，验证转化子得知gfp基因均能正常表达，并且在紫外激发下产生绿色荧光。　　4)利用等离子对产黄青霉进行诱变育种，通过探索不同的诱变条件，确定孢子浓度为105/mL诱变平台距离为2 mm诱变时间为150s的诱变条件。