宫颈癌(cervical cancer,CC)是常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一。近年来有明显年轻化趋势,对女性的身心健康和生育带来极大的威胁,目前对宫颈癌的治疗主要有手术、化疗及放疗,尽管能有效去除和杀伤肿瘤细胞,但手术和放化疗对组织器官的损伤、生育能力丧失以及相关并发症的产生严重影响患者生活质量。因此,对于年轻早期宫颈癌以及癌前病变患者,不耐手术以及放化疗的患者,迫切需要寻找创伤小、能保留器官的治疗方法,在保证治疗效果的前提下,提高患者生存质量。光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)是近年来发展的一种新兴的非手术治疗癌症和癌前病变的方法,主要是通过口服或局部应用光敏剂,经过一段时间集聚在肿瘤细胞和周围组织中,在特定波长可见光的照射下,光敏剂被激活,在分子氧的参与下产生活性氧(Reactive oxygen,ROS)等活性分子,从而对病变组织产生特异性杀伤作用,对周围器官损伤较小,可以保留组织器官的解剖和功能完整。近年来光动力疗法在皮肤科得到广泛应用和研究,在皮肤癌前病变和原位癌的治疗中取得了显著的效果,随着研究的深入极大的拓展了其适应症,在治疗食管癌、胆管癌以及早期肺癌中均有报道,并在疾病的诊断与定位方面也显示出其独特的优势。但光动力疗法在宫颈癌及癌前病变的应用和研究刚刚起步,且由于激光的穿透力有限以及在光动力治疗过程中可能出现耐受现象,光动力疗法在临床的应用受到一定的限制。因此,如何提高PDT治疗效果,对推动PDT的发展具有重要意义。表观遗传学(Epigenetics)即由DNA序列以外的修饰而导致的基因表达的改变,被认为是疾病发生的关键因素,DNA甲基化是表观遗传学重要的组成部分。DNA甲基化是导致肿瘤抑癌基因功能丧失的重要机制之一,在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。PAX1是PAX家族成员,在动物体内广泛存在。有研究发现在宫颈癌组织中存在PAX1基因的高度甲基化,且从癌前病变到宫颈癌的发展过程中,PAX1基因甲基化程度逐渐增加。5-Aza-Cd R是DNA甲基化转移酶抑制剂,通过去甲基化作用逆转基因的高甲基化状态从而发挥抗肿瘤作用。以往有研究表明5-Aza-Cd R可抑制宫颈癌Hela、Siha细胞的增殖,并且药物浓度越高,抑制作用越强。但5-Aza-Cd R联合光动力疗法对宫颈癌细胞的作用效果尚不明确。因此本实验欲研究光动力疗法和去甲基化药物5-Aza-CdR对宫颈癌Hela、Siha细胞株增殖的影响,以及PAX1基因、5-Aza-Cd R和光动力疗法间的关系,以期为宫颈癌的治疗提供新的思路。材料和方法1光动力疗法对宫颈癌Hela、Siha细胞的抑制作用(1)CCK-8法检测在单纯5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)的不同浓度、单纯5-ALA不同孵育时间以及单纯光照的不同剂量处理下对宫颈癌Hela、Siha细胞抑制率的影响。(2)CCK-8法检测在不同5-ALA浓度、不同5-ALA孵育时间以及不同光照剂量下5-氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法(5-ALA-PDT)对宫颈癌Hela、Siha细胞的抑制率的影响。(3)光学显微镜观察5-ALA-PDT作用前后宫颈癌Hela、Siha细胞的形态学改变2 PDT联合去甲基化药物5-Aza-Cd R对宫颈癌Hela细胞、Siha细胞抑制作用(1)甲基化特异性PCR(MSP)检测宫颈癌Hela细胞、Siha细胞PAX1基因的甲基化状态。(2)CCK-8法检测单纯5-Aza-CdR对宫颈癌Hela、Siha细胞的抑制作用。(3)CCK-8法检测5-Aza-CdR联合PDT对宫颈癌Hela、Siha细胞的抑制作用。(4)甲基化特异性PCR检测单纯5-Aza-Cd R、单纯PDT以及5-Aza-Cd R联合PDT处理宫颈癌Hela细胞、Siha细胞,并检测细胞PAX1基因的甲基化状态。(5)Western Blot检测单纯5-Aza-CdR、单纯PDT以及5-Aza-CdR联合PDT时宫颈癌Hela、Siha细胞凋亡蛋白P53的表达。(6)Annexin V-FITC/PI双染并结合流式细胞仪检测5-Aza-Cd R联合PDT时对宫颈癌Hela、Siha细胞凋亡的影响。结果1光动力疗法对宫颈癌Hela、Siha细胞杀伤作用研究(1)根据CCK-8结果可得不同5-ALA浓度、不同孵育时间以及不同的光照剂量对宫颈癌Hela、Siha细胞抑制作用均较弱,宫颈癌Hela、Siha细胞抑制率相比无明显差异(P>0.05)。(2)当5-ALA与光照联合作用时,5-ALA-PDT对宫颈癌Hela、Siha细胞有明显的杀伤作用,与单纯5-ALA、单纯光照处理对比,5-ALA-PDT对宫颈癌细胞抑制作用差异有统计学意义(P<0.05)。(3)光学显微镜观察5-ALA-PDT作用后的细胞,宫颈癌Hela、Siha细胞均出现不同程度的坏死,细胞失去原有形态,变小,核固缩,细胞崩解坏死。2去甲基化药物5-Aza-CdR联合PDT对宫颈癌Hela细胞、Siha细胞抑制作用(1)甲基化特异性PCR检测后发现宫颈癌Hela、Siha细胞PAX1基因均存在高度甲基化现象;(2)单纯5-Aza-Cd R对宫颈癌Hela、Siha细胞抑制无明显作用,Hela、Siha细胞的抑制率差异无统计学意义(P>0.05);(3)PDT联合5-Aza-Cd R时对宫颈癌Hela、Siha细胞杀伤作用明显增强,当5-Aza-Cd R浓度为5μmmol/L时,宫颈癌Hela细胞对联合作用更为敏感,与Siha细胞相比差异有统计学意义(P<0.05);(4)MSP检测后发现,单纯PDT、单纯5-Aza-Cd R、以及5-Aza-Cd R联合PDT处理均可不同程度逆转宫颈癌Hela、Siha细胞PAX1基因甲基化程度;与对照组相比,PDT处理对宫颈癌细胞PAX1基因甲基化程度改变较弱;单纯5-Aza-Cd R组和PDT联合5-Aza-Cd R组甲基化状态逆转最为明显;单纯5-Aza-Cd R组、5-Aza-Cd R联合PDT组PAX1基因甲基化程度与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。(5)Western blot检测各组凋亡蛋白后发现,单纯PDT、单纯5-Aza-Cd R以及PDT联合5-Aza-Cd R时宫颈癌Hela、Siha细胞凋亡蛋白P53均有表达,其中PDT联合5-Aza-Cd R组P53凋亡蛋白的表达水平明显增高。(6)Annexin V-FITC/PI双染并结合流式细胞仪检测PDT联合5-Aza-CdR时宫颈癌Hela、Siha细胞凋亡情况,结果显示:5-Aza-Cd R联合PDT处理对宫颈癌Hela、Siha细胞均有较强的抑制作用,宫颈癌Hela、Siha细胞凋亡明显增加。结论1 PDT可诱导宫颈癌Hela、Siha细胞凋亡增加,其抑制效果显示出5-ALA浓度、孵育时间以及光照剂量依赖性。2宫颈癌Hela、Siha细胞中PAX1基因均呈高甲基化状态,单纯5-Aza-Cd R、单纯PDT以及5-Aza-Cd R联合PDT处理均可不同程度逆转宫颈癌Hela、Siha细胞PAX1基因甲基化程度,其中5-Aza-Cd R联合PDT抑制作用最为明显。3 5-Aza-CdR联合PDT对宫颈癌Hela、Siha细胞抑制作用明显增强,引起细胞凋亡增加,联合作用较单独5-Aza-Cd R及单独PDT作用时抑制效果更为明显。