论文部分内容阅读
由于未来对燃料需求的上升,原油的价格也随之增长,在对生物能源的需求预计将在未来几年大幅增加。在潜在的可替代生物能源的物质中,木质纤维被认为是主要生物燃料的来源和具有高附加值的产品。将木质纤维素中的纤维素和半纤维素水解成葡萄糖和戊糖并发酵生产乙醇正在被广泛地研究。阿拉伯糖是半纤维素的组成成分之一。由于酿酒酵母缺乏L-阿拉伯糖异构酶(AI)、L-核酮糖激酶(RK)和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(RPE)而不能直接代谢阿拉伯糖生成乙醇。本项目研究L-阿拉伯糖异构酶(AI)、L-核酮糖激酶(RK)和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(RPE)的基因克隆以及在酵母中的表达以及活力分析。
本实验通过PCR法扩增到了阿拉伯糖操纵子的三个结构基因口ai、rk和rpe,并使其基因的3’末端融合了His标签,有利于其蛋白的纯化。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后将其克隆进pPIC9K和pGAP9K表达载体,获得带有pAOX1启动子的诱导型重组表达质粒(pPIC9K-ai、pPIC9K-rk和pPIC9K-rpe)和带有pGAP启动子的组成型重组表达质粒(pGAP9K-ai和pGAP9K-rpe)。
用Bg1Ⅱ酶切、线性化重组质粒后,用电击法将重组载体转化毕赤酵母GS115,经PCR检测获得含目的蛋白的酵母工程菌。通过G418筛选法获得多拷贝重组菌株。经700μg/mL的G418抗生素筛选得到诱导型阳性菌株GS115(pPIC9K-ai)、GS115(pPIC9K-rk)和GS115(pPIC9K-rpe)组成型阳性株GS115(pGAP9K-ai)和GS115(pGAP9K-rpe)。
外源蛋白的表达在摇瓶中进行。GS115(pPIC9K-ai)、GS115(pPIC9K-rk)、GS115(pPIC9K-rpe)以甲醇为唯一碳源,而GS115(pGAP9K-ai)和GS115(pGAP9K-rpe)以甘油为唯一碳源。SDS-PAGE分析结果显示,L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶成功地在P.pastoris中分泌表达。用糖酵解法进行活性分析表明这些摇瓶表达的重组酶都具有酶活性。
利用电转化技术将线性化后的pGAP9K-ai质粒转化酿酒酵母京龙Ⅰ号,经过G418抗性筛选获得高基因拷贝重组子JL1(pGAP9K-ai)。摇瓶发酵工程菌株JL1(pGAP9K-ai)表达L-阿拉伯糖异构酶,用糖酵解法作活性分析表明这些摇瓶表达的重组酶都具有酶活性。
综上所述,本实验成功地克隆了L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶基因,实现了在毕赤酵母中表达L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶和在酿酒酵母中表达L-阿拉伯糖异构酶。同时,证明了酵母表达的来源于E.coli的L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶具有活性。为今后构建直接利用来自半纤维素的阿拉伯糖的酿酒酵母工程菌,直接代谢阿拉伯糖生成乙醇,以及生产重组L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶而应用于半纤维素乙醇的生产打下基础。