茶树ADH基因家族的鉴定和CsADH17基因表达模式分析

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乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH,EC 1.1.1.1)是氧化还原酶,它具有高度保守结构域,是脱氢酶/还原酶(dehydrogenase/reductase,MDR)蛋白基因超家族成员之一,前人Chase(1999)将植物ADH家族划分为ADH0、ADH1、BAD1、CAD1、CAD2、FDH1、KELa、TRR1、TRR2等几个亚家族。ADH广泛存在于生物之中,一般以NAD+和NADP+为辅酶,在植物生长发育,抵抗干旱、涝害、冷害、低氧和盐害等非生物胁迫过程中起着重要的作用。茶树(Camellia sinensis(L.)O.Ktze)作为我国的重要经济作物,良好的生态环境是茶树正常生长、茶叶形成品质的主要影响因素,然而,茶树生长过程中不可避免受到干旱、低温等多种逆境胁迫,极大的影响了其产量和品质。但目前对茶树ADH家族及其家族基因在茶树中逆境相关的研究较少,本研究围绕茶树ADH基因家族进行研究,对其进行生物信息学分析茶树ADH基因家族成员的基本生物信息(包括系统进化树、保守结构域、蛋白基序、染色体定位、非生物胁迫表达模式分析等)。通过选取基因家族中表达量高的基因,设计基因引物,进行实时荧光定量分析,验证其结果与基因组数据库预测结果是否相关。对CsADH17基因进行克隆并遗传转化烟草,对转基因烟草非生物胁迫下的表达量和相关生理指标进行测定与分析,以了解茶树ADH基因家族相关基因在茶树中逆境调控的方式,为进一步揭示CsADH在茶树生长发育以及抗逆响应中提供参考依据,主要研究结果如下:1.CsADH基因家族的鉴定与分析利用TBtool上的BLAST功能,根据已发表的茶树数据筛选出51个茶树ADH基因家族成员及理化性质预测。利用生物信息学方法对茶树ADH基因家族进行分析,根据结构域将51个茶树ADH基因分成了2个组,其中第2组成员最多,包含有41个CsADH成员,第1组CsADH成员有10个。基因结构和保守基序分析发现,大多数基因高度保守,彼此具有很大的相似性。从茶树八个组织表达模式分析发现,大多数CsADH在各个组织中均有表达,其中在嫩叶中的表达量高于其他组织的表达量。不同非生物胁迫表达模式表明,茶树ADH基因都参与了茶树对非生物胁迫下的调控,在不同非生物胁迫下有着不同程度的响应,茶树是叶用经济作物,选取在嫩叶中表达量高的茶树ADH基因能够提高茶树的经济价值。2.5个CsADH基因的定量表达分析通过实时荧光定量分析5个基因(CsADH17、CsADH23、CsADH26、CsADH35、CsADH44)在干旱和低温胁迫下茶树中的表达模式。在低温处理0~24下,CsADH17随着时间的推移表达量逐渐增高,CsADH23、CsADH26和CsADH35的表达量为先降低后升高,而CsADH44的表达量在一开始最高,随后降低;在干旱处理0~72 h中,CsADH17在48 h时表达量最高,CsADH23、CsADH26和CsADH35的表达量为先降低后升高,在72 h时表达量最高,CsADH44的表达量大致走向由高到低。综合干旱和低温胁迫下茶树中的表达模式,选取CsADH17基因在烟草中的功能验证。3.CsADH17基因在转基因烟草中的功能验证为鉴定CsADH17基因在植物体中的功能,构建了茶树CsADH17基因的过表达载体p BWA(V)KS-CsADH17,通过农杆菌介导的叶盘转化法对烟草叶片进行遗传转化,对转基因烟草植株进行GUS组织化学染色及提取DNA的提取进行PCR鉴定。结果显示:野生型烟草植株未检测到GUS活性,转基因烟草植株检测到GUS活性,在野生型植株中未检测出目的条带,而转基因植株中检测到了预期的目的条带,最终获得CsADH17转基因烟草植株。对野生型烟草植株和CsADH17转基因烟草植株进行干旱胁迫处理表明,与野生型相比,CsADH17转基因烟草植株在干旱胁迫处理下相对表达量较高。通过测定野生型烟草植株和CsADH17转基因烟草植株干旱胁迫处理21 d后抗氧化酶活性的结果表明,干旱胁迫处理21 d后,CsADH17转基因烟草植株叶片中的CAT、POD、SOD和APX的活性均高于野生型烟草植株。同时,CsADH17转基因烟草叶片中MDA含量显著低于野生型烟草,表明CsADH17转基因烟草植株的抗干旱胁迫能力明显提高。通过GC-MS测定,CsADH17基因提高了转基因烟草中的烟碱、新植二烯、苯甲醇、苯甲醛、二氢猕猴桃内酯和二烯烟碱等六种香气成分含量,增进了烟叶的吃味和香气,同时降低了烟叶的刺激性和苦涩味,令烟叶中的香气更加柔和。
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