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气孔是植物表皮的特有结构,其孔径大小和密度分布直接决定植物叶片光合作用的效率和作物产量,是农业生产中很重要的形态学指标。气孔的发育过程受到严格的“单细胞间隔原则”调控,其中表皮模式因子（Epidermal pattern factors,EPFs）是关键环节,EPF1和EPF2为负调控子,EPFL9为正调控子。气体信号分子H2S（hydrogen sulfide,H2S）参与植物生长发育和响应逆境胁迫的诸多过程,其中H2S调节气孔运动的作用机制备受关注。相对而言,H2S信号对气孔发育的影响却鲜有报道。因此,开展H2S对叶片气孔发育调节机制的研究,为深入了解H2S气体信号在植物响应逆境胁迫过程中的作用机制提供更多思路。本研究以模式植物拟南芥为材料,探究气体信号H2S参与拟南芥EPFs多肽调节气孔发育的作用机制,主要结果如下:1.H2S主要生成酶编码基因缺失的突变体lcd、des1和lcd/des1与野生型WT相比,叶片气孔密度显著降低;WT+HA与野生型WT相比,新生叶气孔密度也显著降低;WT+NaHS和WT+HT处理组的新生叶气孔密度与野生型WT相比无明显变化;lcd/des1+NaHS与lcd/des1相比,新生叶气孔密度得到恢复。lcd、lcd/des1和WT+HA与WT相比,新生叶气孔指数有降低的趋势;des1、WT+NaHS、lcd/des1+NaHS和WT+HT与WT相比,新生叶气孔指数有升高的趋势;但所有处理组的气孔指数无显著性差异。与WT相比,所有处理组的新生叶保卫细胞的大小无显著变化。以上结果说明,H2S信号参与调控植物叶片的气孔发育过程。2.与WT相比,突变体lcd、des1、lcd/des1、WT+HA和WT+HT的新生叶的H2S含量和产率显著降低。与WT相比,WT+NaHS、lcd/des1+NaHS的新生叶的H2S含量显著升高。与WT相比,lcd/des1+NaHS的新生叶的H2S产率显著降低,WT+NaHS的新生叶的H2S产率有升高的趋势,但无显著性差异。以上结果说明,新生叶的H2S含量和产率变化可能是导致新生叶气孔发育出现差异的原因。3.生理浓度NaHS处理WT 0.5 h时,EPFs编码的基因变化趋势比较明显,EPF1和EPF2基因呈显著下降趋势,而EPFL9呈显著升高趋势。突变体lcd、des1和lcd/des1与野生型WT相比,新生叶片EPF2基因表达呈显著升高趋势;lcd/des1+NaHS与野生型WT相比,新生叶片EPFL9基因表达呈显著升高趋势。以上结果说明,EPFs的编码基因会在短时间内响应H2S信号,内源H2S与外源H2S的参与对拟南芥EPFs的基因响应不同。4.拟南芥表皮模式因子EPFs的原核表达载体的构建、EPFs多肽的诱导表达和纯化。以拟南芥cDNA为模板,克隆EPF1、EPF2和EPFL9基因,得到重组质粒pET28a-EPF1、pET28a-EPF2和pET28a-EPFL9;将重组质粒分别转入大肠杆菌BL21（DE3）进行异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。优化后的表达条件:IPTG诱导浓度分别为0.5、0.3和0.05 mM;最适诱导温度分别为28℃、28℃和16℃;最适诱导时间分别为16 h、16 h和20 h;经Ni琼脂糖凝胶柱纯化获得融合蛋白,大小分别为18 kDa、19 kDa和14.5 kDa左右。5.H2S处理体外表达纯化的EPFs融合蛋白,经生物素开关法进行巯基化检测。结果表明EPF2和EPFL9蛋白的巯基化信号于对照比显著升高,EPF1蛋白未见显著变化。说明H2S在调节拟南芥气孔发育中,可能主要是通过巯基化修饰EPF2和EPFL9蛋白发挥作用的。综上所述,H2S信号通过EPFs多肽参与到拟南芥气孔发育的调节作用中,H2S调节EPFs的转录表达,巯基化修饰EPF2和EPFL9蛋白,进而影响拟南芥气孔的发育,提高拟南芥叶片下表皮的气孔密度。为后续深入研究气体信号H2S对植物气孔发育的作用机制提供基础数据,对增加作物产量、增强植物抗逆性有重要意义。