产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)作为食源性致病菌中的一种,其致病能力极强,被感染者容易形成出血性结肠炎或血性腹泻,严重者可进一步发展为溶血性尿毒综合征,危及生命。STEC广泛分布于生活环境中,在食品制作、加工、包装以及运输过程中极易感染此菌。建立一种快速、简便的产志贺毒素大肠埃希氏菌检测与分型方法有助于更好地开展食品安全的检测,进一步降低STEC的感染风险。本研究利用不对称聚合酶链式反应(Asymmetric Polymerase Chain Reaction,aPCR)结合免疫层析技术(Immu-nochromatographic Assay,ICA),快速检测并准确分型产志贺毒素大肠埃希氏菌STEC标志性毒力基因stx,主要内容和结果如下:首先,建立快速检测STEC标志性毒力基因stx的方法。利用不对称PCR技术分别制备生物素标记的stx1和stx2目标基因单链DNA,该扩增产物与红色聚苯乙烯微球标记的stx1和stx2目的基因上游引物特异性结合,结合物上的生物素基团与免疫层析试纸条上的链霉亲和素特异性结合而显色,实现对STEC标志性毒力基因stx的检测。对检测条件进行优化,结果显示:stx1不对称PCR体系中stx1F:Biotin-stx1R最佳引物浓度比为1:7,stx2不对称PCR体系中stx2F:Biotin-stx2R则为1:4,不对称PCR最佳循环次数为55,最佳退火温度为55℃,stx1与stx2的最佳引物加入量均为3μL(Biotin-stx1R与Biotin-stx2R浓度均为2μM),标记物聚苯乙烯微球最佳封闭剂为1%的BSA,最优加入量为20μL。利用所建立的方法能准确地检测出含有stx基因的STEC,且对不含stx基因的菌株显示阴性检测结果,具有良好的检测特异性。其次,建立快速分型stx1和stx2的方法。利用双重不对称PCR(Duplex aPCR)制备地高辛标记的stx1目标基因单链DNA与生物素标记的stx2目标基因单链DNA,该扩增产物与被红色聚苯乙烯微球标记的stx1和stx2目标基因上游引物特异性结合,结合物上的地高辛和生物素分别与试纸条上的抗地高辛抗体和链霉亲和素特异性结合并显色,根据不同检测线的显色情况,判断菌株所携带的不同类型的stx基因。对检测条件进行优化,结果显示:双重不对称PCR体系中stx1F:Digoxin-stx1R与stx2F:Biotin-stx2R引物浓度最佳比例皆为1:6,最佳循环次数为45,最佳退火温度为59℃,stx1与stx2的最佳引物加入量均为3μL(Digoxin-stx1R与Biotin-stx2R浓度均为2μM),标记物聚苯乙烯微球的最佳封闭剂为Seablock,最适加入量为50μL。利用该方法对不同stx基因型的STEC菌株进行检测,结果显示该方法能够准确地分型检测stx1与stx2基因。最后,利用本实验建立的stx基因分型检测法对20株菌株进行stx基因的检测与分型,结果显示该方法可准确地检测出含有STEC标志性毒力基因stx的菌株并实现准确分型。该方法对于非产志贺毒素菌株呈现阴性检测结果。具有选择性高且快速、准确和安全的优点,结果判定便利、直观,可实现现场快速检测的目的,适合基层实验室使用。