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流行病学调查显示,青少年和成年肥胖、代谢综合征的发生率呈全球性增加。非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是代谢综合征在肝脏内的特征性表现,生命早期营养不仅影响儿童生长发育轨迹,也与成年期肥胖及代谢综合征的发生密切相关。因此,积极探讨早期营养程序化发展机制,并进行早期干预对降低远期NAFLD的发病风险有重要意义。研究证实,肝脏脂代谢包括游离脂肪酸摄取、合成、氧化和输出四个途径,涉及乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)、脂肪酸合成酶(FASN)、脂蛋白酯酶(LPL)、肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)和微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)及其核受体固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)和过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPARα)的参与。本研究小组运用经典的小窝鼠模型,模拟哺乳期婴儿过度喂养的饮食环境,证明哺乳期是肝脏脂合成相关酶ACC及其核受体SREBP-1c发育编程的窗口期。哺乳期营养过度主要影响ACC活性,增加肝脏脂合成及脂质的沉积,由此促进断乳后高脂诱导的肥胖和NAFLD的发生。业已证明,鱼油富含ω3多不饱和脂肪酸(ω3 polyunsaturated fatty acid,ω3PUFA),其在肝脏脂代谢、炎性反应等方面具有重要的调节作用,并可通过增强胰岛素敏感性、降低肝脏脂肪沉积及改善炎性反应影响NAFLD的发生发展。断乳后补充鱼油能否改善早期营养过度导致的肝脏脂合成异常?若能,其是否通过调控ACC发挥作用?开展上述问题的研究,有助于阐明ω3PUFA在早期预防肥胖和肝脏脂质沉积发生发展中的作用以及可能的分子机制,最终为早期预防NAFLD提供新的思路和潜在的分子靶标。第一部分鱼油膳食对哺乳期营养过度大鼠成年期肝脏脂代谢的影响目的探讨断乳后鱼油膳食干预对早期营养过度大鼠生长发育、成年期肝脏脂代谢及其相关酶的影响,为降低成年期NAFLD发生风险提供科学依据。方法1、建立早期营养过度模型:将生后3天的SD大鼠(雄性)随机分为哺乳期正常营养组(normal litter,NL,10只/窝)和营养过度组(small litter,SL,3只/窝)。3周后分别给予正常膳食(NF)和ω3PUFA膳食(FO)至13周,分为四组:NL、SL、NL-FO、SL-FO 组。2、动态记录大鼠每周体重及摄食量。13周时进行糖耐量实验和血脂测定,动物处死后,肝脏组织称重并测量肝脏内TG含量,对肝脏切片进行病理分析及NAS评分。3、检测肝脏脂合成酶表达水平;Realtime PCR检测ACC、SCD1、FASN及SREBP-1cmRNA水平;同位素标记方法检测肝脏ACC酶活性;免疫印迹方法检测肝脏SREBP-1c蛋白表达水平。结果1、与NL组大鼠相比,SL组大鼠体重明显增加并出现血清TG水平增加,糖耐量下降;而SL-FO组大鼠体重和血清TG水平明显低于SL组,糖耐量恢复正常;NL-FO大鼠体重低于NL组,血清TG及糖耐量与NL组无统计学差异。2、与NL组大鼠比较,SL组大鼠肝脏重量、肝指数及肝脏内TG含量持续增加,肝细胞内脂滴增加,可见气球样变及炎性浸润;而SL-FO组肝脏重量、肝指数及肝脏内TG含量均低于SL组;NL-FO组肝脏重量下降,但肝指数及肝脏内TG含量与NL组无统计学差异。SL-FO、NL-FO与NL组大鼠肝细胞结构无异常改变。3、SL组大鼠脂合成酶ACC,FASN及SCD1 mRNA水平高于NL组,而SL-FO组大鼠ACC,FASN及SCD1mRNA水平下降,NL-FO组与NL组相比无统计学差异;ACC酶活性变化趋势与ACC mRNA表达一致。4、各组大鼠肝脏SREBP-1c表达水平与ACC表达水平相似:SL大鼠SREBP-1c mRNA水平持续高于NL组,而SL-FO组SREBP-1c mRNA水平较SL组下降。NL-FO组与NL组无统计学差异。SREBP-1c mRNA与蛋白表达一致。结论哺乳期营养过度导致肝脏脂合成代谢增加并持续至成年期,而断乳后鱼油膳食干预可逆转ACC和SREBP-1c程序化改变,恢复肝脏脂合成代谢,进而降低成年期罹患NAFLD的风险。第二部分二十碳五烯酸调控肝脏细胞乙酰辅A羧化酶的分子途径目的探讨二十碳五烯酸通过固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)对肝脏细胞(HepG2细胞)乙酰辅酶A羧化酶(ACC)基因表达的调控机制。方法1、建立肝细胞脂质诱导和干预模型:以油酸钠(OA)+胰岛素诱导法对HepG2细胞进行诱导分化24h,HepG2细胞脂堆积诱导成功后,加入EPA刺激,或siRNA干扰技术阻断HepG2细胞中SREBP-1c的表达后再进行脂诱导实验。2、肝细胞脂质积聚的监测:油红O染色技术观察肝细胞脂质堆积变化,TG检测试剂盒检测肝细胞内TG含量。3、HepG2细胞脂合成酶和受体途径:Realtime PCR检测ACC和SREBP-1c mRNA表达;同位素法检测肝细胞ACC酶活性;Western blot检测肝细胞SREBP-1c蛋白表达。结果1、油红O染色发现,OA诱导后肝细胞内脂滴增多增大,加入EPA刺激后,脂滴变小且数目明显下降;阻断SREBP-1c后,OA诱导下肝细胞内脂滴增加减少,再次EPA刺激也无明显下降。细胞内TG含量变化与油红O染色结果一致。2、OA诱导下ACC mRNA表达水平较对照组明显升高,EPA刺激24h后,ACC mRNA表达水平明显下降;SREBP-1c阻断后,OA诱导的ACC mRNA表达作用减弱,同时EPA对ACCmRNA也无进一步下调作用。ACC酶活性与mRNA水平变化趋势一致。3、与ACCmRNA表达趋势相一致,SREBP-1cmRNA表达水平在OA诱导后明显升高,EPA刺激可抑制其表达。SREBP-1c阻断后,OA与EPA对SREBP-1c调控作用消失。SREBP-1c蛋白与mRNA表达水平一致。结论二十碳五烯酸(EPA)抑制OA诱导下肝细胞ACC表达和脂质堆积,SREBP-1c是ω3PUFA调控肝脏细胞脂合成的重要分子途径。综上所述,我们以生命早期营养为重点,以肝脏脂合成为研究主线,应用动物模型,观察哺乳期营养过度以及断乳后鱼油膳食对肝脏脂合成及其相关酶ACC发育模式的影响。研究证明,断乳后鱼油膳食干预,可以逆转早期营养过度导致的ACC活性的持续增加,改善成年期肝脏脂质沉积,降低NAFLD发生风险,而SREBP-1c是ω3PUFA抑制肝脏细胞ACC表达调控的重要分子途径,研究结果为成年期NAFLD的早期干预提供了重要靶标、窗口期和干预手段,因此具有重要的科学意义和临床价值。