【摘 要】
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目的:在急性胰腺炎的发病机制中,胰腺导管上皮屏障的损伤发挥着重要的作用,而核因子κB（Nuclear Factor-kappa B,NF-κB）信号通路的活性与胰腺导管上皮屏障的破坏密切相关,因此本研究的目的为探讨NF-κB信号通路在胰腺导管上皮屏障损伤中的作用。方法:采用人胰腺导管腺癌细胞HPAF-Ⅱ作为细胞模型,分别使用TNF-α和PDTC对细胞进行干预,细胞被分为control组、TNF-α
【基金项目】
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项目名称:肌球蛋白轻链激酶在NF-κB介导的胰腺导管上皮屏障损伤中的作用,项目合同编号:2015GXNSFAA139184,项目来源:广西自然科学基金,项目起止时间:2015-04-01至2018-03-31
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目的:在急性胰腺炎的发病机制中,胰腺导管上皮屏障的损伤发挥着重要的作用,而核因子κB（Nuclear Factor-kappa B,NF-κB）信号通路的活性与胰腺导管上皮屏障的破坏密切相关,因此本研究的目的为探讨NF-κB信号通路在胰腺导管上皮屏障损伤中的作用。方法:采用人胰腺导管腺癌细胞HPAF-Ⅱ作为细胞模型,分别使用TNF-α和PDTC对细胞进行干预,细胞被分为control组、TNF-α组、PDTC组:①采用实时荧光定量PCR法及免疫印迹法检测细胞p65 m RNA及蛋白表达水平和p-p65的蛋白水平以评估NF-κB信号通路的活性;②采用免疫印迹法检测紧密连接（Tight Junctions,TJs）相关蛋白claudin-1的蛋白表达;③采用实时荧光定量PCR法、免疫印迹法、酶联免疫吸附试验、免疫荧光及免疫组化法检测细胞中肌球蛋白轻链激酶（Myosin Light Chain Kinase,MLCK）的表达水平及定位;○4透射电镜观察胰腺导管细胞间TJs的结构,通过测量单层上皮细胞荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖（Fluorescein Isothiocyanate Dextran,FITC-D）的通透率来检测药物干预后单层细胞的通透性改变。结果:①在HPAF-Ⅱ细胞中TNF-α上调NF-κB p65的表达水平及磷酸化,PDTC则下调NF-κB p65的表达及磷酸化水平,提示NF-κB信号通路被TNF-α激活,被PDTC抑制;② TNF-α组细胞中claudin-1蛋白表达水平较control组下降,PDTC组细胞中claudin-1蛋白表达水平较control组升高,说明NF-κB信号通路的激活下调了claudin-1表达水平;③实时荧光定量PCR结果显示与control组比较,TNF-α组的MLCK m RNA表达上调（P<0.05）,免疫印迹和酶联免疫吸附试验结果显示与control组相比,TNF-α组的MLCK蛋白表达升高,PDTC组的MLCK蛋白表达下降（P<0.05）,MLCK的表达水平与NF-κB信号通路的活性呈正相关;免疫荧光及免疫组化结果显示TNF-α组细胞中MLCK呈强表达,主要表达于胞质中,而PDTC组细胞中MLCK表达微弱;○4电镜观察TNF-α组细胞间TJs较control组明显增宽,说明NF-κB信号通路激活后细胞间TJs增宽;PDTC组单层细胞通透率较control组明显下降（P<0.05）,说明NF-κB信号通路抑制后细胞间通透性降低。结论:①调控NF-κB信号通路可影响胰腺导管上皮细胞间紧密连接及细胞通透率。②调控NF-κB信号通路对胰腺导管上皮屏障的影响机制与claudin-1和MLCK表达水平改变有关。
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