维生素B₁₂(vitamin B₁₂;vB₁₂),是一种唯一含金属原子的维生素,在调节人的神精经系统以及血液循环系统中起着不可忽视的作用。本文主要研究和建立了酶联免疫分析方法（Enzyme linked immunosorbent assay;ELISA）、化学发光酶联免疫分析法（Chemiluminescence enzyme-linked immunosorbent assay;CL-ELISA）以及高效液相色谱（High performance liquid chromatography;HPLC）等快速检测vB₁₂的方法,这对监管vB₁₂食品或药品的真实含量、保护消费者的权益与人身健康有着重要的意义。本研究采用羰基二咪唑法（CDI）将vB₁₂分别与钥孔血蓝蛋白（KLH）和牛血清（BSA）偶联,制得了免疫抗原(vB₁₂-KLH)与包被抗原(vB₁₂-BSA)。通过紫外扫描图表征了这两种抗原偶联成功,vB₁₂-KLH与vB₁₂-BSA的偶联比分别是6:1和4:1。用免疫原(vB₁₂-KLH)免疫6周龄的Balb/c雌性小鼠,经细胞融合后成功获得分泌抗vB₁₂抗体的杂交细胞株4A1,其分泌的抗体为κ轻链IgG 2a亚型,抗体经蛋白A柱纯化后,通过对溶液体系的pH、盐浓度和有机溶剂浓度等一系列的优化,建立了检测vB₁₂的间接竞争ELISA方法。ELISA竞争抑制率曲线的IC₅₀为10.5 ng/mL,最低检测限(IC₁₀)为0.2 ng/mL,检测范围为2–100 ng/mL,相关系数R²=0.993;且该抗体具有较强的特异性,在三种结构相似物中,与羟钴胺的交叉反应率为2.31%;与甲钴胺的交叉反应率为0.53%;与腺苷钴胺的交叉反应率仅为0.27%,与其他的B族维生素没有交叉反应,间接ELISA测出片状保健品中vB₁₂的回收率为86.02–110.54%,变异系数（CV）为2.6–10.5%,经液相验证后得出出该方法具有准确,快速和灵敏等特点,能满足市场上vB₁₂片状保健品的检测需求。在此基础上,进一步建立了CL-ELISA法,其线性范围为0.5–20 ng/mL,R²=0.991,在药片的加标回收率为91.5–102.9%,变异系数5.1–10.78%（n=6）;在饮料中的加标回收为81.6–92.2%,变异系数7.6–13.71%（n=6）;在奶粉中的加标回收率为78.7–84.5%,变异系数8.2–12.7（n=6）。实际样品经过CL-ELISA检测、免疫亲和柱-高效液相法（ICA-HPLC）验证后,得出该方法具有可行性与可靠性,能够满足vB₁₂在药片、饮料以及奶粉样品中的检测。另外,本论文还探索了吖啶酯（NSP-SA）直接标记抗体的化学发光法以及双特异性抗体联合化学发光系统检测vB₁₂法,得到其检测范围为2.5–25 ng/mL（R²=0.989）,IC₅₀为10.2 ng/mL,最低检测为1 ng/mL。同时,本文采用Traut’s reagent/Sulfo-smcc化学偶联法制备了抗vB₁₂/NSP-SA双特异性抗体,经过条件优化后得到检测范围为1–25 ng/mL（R²=0.9928）,IC₅₀为5.21 ng/mL,最低检测限为0.1 ng/mL。