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研究牛精子发生过程中的DNA甲基化,寻找与精子发生相关的基因,结合干细胞的体外培养与诱导,建立体外诱导干细胞分化形成功能性生殖细胞的完整体系,从而推进畜禽遗传育种、品种改良以及转基因品种的培育。精子发生包括有丝分裂、减数分裂和精子形成三个阶段,该过程中DNA甲基化起重要作用。DNA甲基化的正常表达调控精子的正确发生,而其异常表达则造成精子功能的异常。本研究通过激光显微切割技术获取牛精子发生过程中四种不同类型的细胞,研究精子发生过程中DNA甲基化的变化,筛选功能性基因;在体外成功分离培养和鉴定牛睾丸间充质干细胞,并使用维甲酸(Retinoic Acid,RA)诱导其向减数分裂前期分化,旨在鉴定体外诱导牛睾丸间充质干细胞向生殖细胞分化的可行性。通过激光显微切割系统,成功获取精原干细胞、初级精母细胞、圆形精子细胞和长形精子细胞,进行单细胞全基因组甲基化测序分析。研究结果表明,精子发生过程中DNA甲基化水平呈动态变化:精原干细胞到初级精母细胞呈高甲基化趋势;初级精母细胞到圆形精子细胞则是高甲基化与低甲基化交叉出现;圆形精子细胞到长形精子细胞则再次表现出高甲基化状态,揭示DNA甲基化对精子发生过程具有调控作用。差异甲基化区域(Differentially methylated regions,DMR)相关基因筛选发现,DNA水平差异最明显的初级精母细胞与精原干细胞组中存在16134个差异基因,圆形精子细胞与初级精母细胞对比组中存在91个DMR相关基因;长形精子细胞与圆形精子细胞对比组中存在97个DMR相关基因。其中,初级精母细胞与精原干细胞组存在多种泛素-蛋白连接酶相关基因(TRI11、SH3R1、ZNRF1、MARH8)和组蛋白-赖氨酸-甲基转移酶相关的基因(KMT2C、EHMT1、SMYD3、NSD3),表明在精子发生过程中泛素-蛋白连接酶可能发挥重要作用,且DNA甲基化与组蛋白修饰保持密切联系。DMR相关基因KEGG分析表明,初级精母细胞与精原干细胞对比组间,Rap1信号通路在调节生殖细胞-支持细胞粘附中具有重要作用,可能是精子发生过程中重要的信号通路。体外成功分离培养牛睾丸间充质干细胞,RT-PCR鉴定该细胞表达CD105、CD166,流式细胞分析鉴定该细胞表达CD44、CD90、CD166且阳性率均在98%以上;克隆形成能力鉴定表明该细胞在体外具备自我更新的潜能;成功诱导为脂肪细胞和成骨细胞,表明该细胞在体外具备多向分化潜能;并使用RA诱导该细胞进入减数分裂阶段。因此可以选取牛睾丸间充质干细胞为研究对象,结合筛选获取的差异基因,在体外研究其向生殖细胞的诱导分化,为建立完整的体外诱导干细胞分化形成生殖细胞奠定基础。