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目的:肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)占全部肺癌的85%。虽然大多数肺癌在初期对化疗较为敏感,并且目前在靶向治疗及免疫治疗中取得了很大的进展,但耐药仍是难以避免的,急需新的思路来开发更加有效的治疗方法。肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)是具有自我更新能力和分化潜能的癌细胞亚群,最新研究表明其参与了肿瘤进展及耐药。我们在前期工作中发现H2B单泛素化(H2Bub1)在肺癌细胞中表达极低甚至缺失,这一现象与肺癌的进展及耐药性密切相关。同时,我们通过RNA测序分析(RNAseq)发现,H2Bub1最重要的泛素特异性蛋白酶22(USP22)可能对乙醛脱氢酶(ALDH)超家族成员ALDH1A3有调控作用。在这项研究中,我们探讨了USP22在具有自我更新能力和分化潜能的肺癌干细胞(Lung cancer stem cells,LCSCs)中的表达和调控作用,并观察了USP22水平变化对LCSCs顺铂耐药性的影响及其相关机制。方法:1.收集美国City of Hope国家医学中心非小细胞肺癌组织标本3例并从中分离含有肺癌干细胞的细胞群,使用双重标记免疫荧光成像分析研究USP22/H2Bub1与干细胞标记物CD133的关联。采用荧光标记的抗人CD133抗体进行流式细胞分选并通过细胞球形成实验、ALDH活性检测、体外分化诱导实验及NOD-SCID gamma(NSG)小鼠体内异种细胞移植成瘤实验鉴定其干细胞特性,确定CD133+细胞群为LCSCs。采用Western Blot方法比较USP22及其相关基因的表达水平在CSCs和非CSCs的肺癌细胞系之间的差异。使用顺铂诱导实验观察药物处理后USP22及其相关基因的变化情况。2.使用sh RNA慢病毒敲低肺癌干细胞中USP22的表达水平构建USP22-KD-LCSCs细胞系,使用Western Blot方法评估USP22敲低对CD133、ALDH1A3、H2Bub1和RNF20等相关基因的影响。通过体外肿瘤球体形成、NSG小鼠体内异种细胞移植成瘤实验和顺铂诱导凋亡实验来研究USP22对肺癌干细胞自我更新能力和顺铂敏感性的影响。3.使用ALDH1A3-si RNA转染敲低肺癌干细胞中ALDH1A3的表达水平,使用Western Blot方法验证ALDH1A3敲低后USP22的表达变化,明确其上下游关系。使用顺铂诱导凋亡实验验证ALDH1A3敲低对肺癌干细胞顺铂敏感性的影响。之后,使用ALDH1A3 ORF c DNA克隆质粒转染恢复USP22-KD-LCSCs中ALDH1A3的表达水平,通过顺铂诱导凋亡实验观察ALDH1A3表达水平恢复后的肺癌干细胞顺铂敏感性的变化。最后,利用染色质免疫沉淀(Ch IP)及定量real-time PCR的方法观察USP22被敲低后,ALDH1A3启动子附近区域的组蛋白H2B单泛素化修饰是否明显增多,从而明晰三者之间的关系。结果:1.免疫荧光成像显示,在分离出的含有肺癌干细胞的细胞群中,CD133高表达的细胞中USP22亦为高表达,而H2Bub1表达降低或缺失。经流式细胞分选后,我们发现CD133+细胞呈球状生长,并可经牛血清(FBS)诱导分化,少量细胞即可在NSG小鼠体内形成肿瘤,验证了CD133+细胞的干细胞特性,即为肺癌干细胞。Western Blot显示肺癌干细胞中USP22和ALDH1A3表达明显较CD133-肺癌细胞高。经顺铂处理后,肺癌干细胞的USP22、ALDH1A3和CD133表达进一步升高,其ALDH活性亦有明显升高。2.敲低肺癌干细胞中USP22后(USP22-KD),其球状生长能力明显降低。Western Blot显示ALDH1A3及CD133表达明显降低,而H2Bub1则显著增高。NSG小鼠异种移植实验显示其成瘤能力明显降低,而顺铂敏感性则显著升高。3.敲低肺癌干细胞中ALDH1A3后,USP22表达并无明显变化。但其顺铂敏感性明显提高。恢复USP22-KD细胞中ALDH1A3表达后,其顺铂耐药性亦得到恢复。敲低USP22的肺癌干细胞中ALDH1A3启动子附近区域的H2Bub1水平显著升高。结论:1.以CD133为标记分选后,CD133阳性的细胞群可确认为肺癌干细胞。肺癌干细胞中USP22和ALDH1A3呈高表达,H2Bub1呈低表达。而USP22、ALDH1A3表达较高的LCSCs顺铂耐药性更高。2.敲低肺癌干细胞中的USP22能够明显降低其成瘤能力以及顺铂耐药性。ALDH1A3的表达亦随之降低,证明USP22与ALDH1A3之间有调控关系。3.ALDH1A3可能处于USP22的下游位置,其可能为肺癌干细胞顺铂耐药性的关键,USP22可能通过调控组蛋白H2B在ALDH1A3启动子附近区域的泛素化水平,间接影响ALDH1A3的转录和表达,从而实现对肺癌干细胞顺铂敏感性的调节。