胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)是我国特有的淡水珍稀物种,亚洲胭脂鱼科的唯一代表,在分类学和动物地理学上占有特殊地位,具有重要的科研价值。同时又因其肉质鲜美,体型奇特,色彩绚丽,具有很高的食用和观赏价值。由于胭脂鱼自身繁殖力低,发育时间长,以及过度捕捞和水域污染等因素使得胭脂鱼数量急剧下降,已被列为我国国家二级水生野生保护动物。科学的人工繁殖放流是恢复其资源的重要途径,但由于高密度的人工养殖导致胭脂鱼病害增加造成较高的死亡率。目前针对胭脂鱼高死亡率问题的研究主要侧重在人工养殖水体的影响,投喂饵料等方面,而对胭脂鱼免疫系统少有关注。本研究试图从胭脂鱼免疫系统结构与功能基本研究入手,为解决胭脂鱼在人工繁殖过程中死亡率高居不下的困境提供新视角和理论依据。在免疫系统中,T淋巴细胞主要介导细胞免疫反应,它通过辅助性T细胞来调节宿主的免疫反应,或者通过细胞毒性T细胞直接破坏被病原体感染的细胞,因此T细胞在鱼类细胞免疫及抗感染过程中起着重要的作用。CD3分子是存在于T淋巴细胞的一种膜表面抗原,与T细胞抗原受体相连,参与T淋巴细胞的信号转导,是T淋巴细胞的重要表面标志。通过制备可用于分选和测定胭脂鱼T淋巴细胞群的CD3单克隆抗体,有助于了解胭脂鱼细胞免疫的功能及状态,为胭脂鱼的致病机理提供一定的理论依据。CD3分子共有五种亚基,分别为ε、δ、γ、ε、δ,不同的肽链互相组成多聚体而存在于T淋巴细胞表面。因CD3分子含有两个ε链,为抗原提供丰富的结合位点,且相对保守,因此本文以CD3ε进行克隆表达。本文首先根据几种已知的硬骨鱼类CD3ε的氨基酸序列设计简并引物,通过同源克隆和RACE技术获得了胭脂鱼CD3ε基因的全长序列,胭脂鱼CD3εcDNA全长1317bp,其中5,非编码区和3,非编码区各157bp和653bp。开放阅读框长507bp,共编码168个氨基酸,预测的等电点为7.76,分子量大小为18.52KD。氨基酸多重比对结果显示,胭脂鱼CD3ε分子与其它物种一样由信号肽区、胞外区、跨膜区和富含酪氨酸活化基序的胞内区组成,并含有如Cxx Cx E基序和跨膜区带负电荷的残基等保守结构。通过构建系统进化树表明胭脂鱼CD3ε分子与鲫鱼、安水金线鲃和滇池金线鲃CD3ε分子聚为一支。RT-PCR检测胭脂鱼CD3ε在不同组织中的分布,结果显示除了在肝脏中表达量较低外,在脾、头肾、肾、PBL、心脏、鳃、肠、脑、皮肤和肌肉中表达量均较高。用灭活的嗜水气单胞菌感染胭脂鱼,qRT-PCR结果显示,在细菌感染的过程中,在胭脂鱼脾脏、头肾、肾、鳃和肠中均出现明显的变化趋势,胭脂鱼CD3εmRNA与对照组PBS相比,在12h时在脾脏、肾和鳃中均呈现极显著的下降趋势,而在24h时,脾脏中CD3ε的表达量又出现显著上调的趋势,而在肾脏和鳃中则持续下降,且最后均恢复至对照组相近水平;胭脂鱼头肾和肠中CD3ε表达量在感染12h后出现上调趋势,之后与对照组相比并无明显变化。扩增胭脂鱼CD3ε胞外区片段并与原核表达载体PET-32a连接转化至大肠杆菌BL21中,经诱导表达和纯化得到胭脂鱼CD3ε重组蛋白。SDS-PAGE和western blot结果表明,胭脂鱼CD3ε重组蛋白分子量大小约为27KD,主要以包涵体形式表达。以重组CD3ε蛋白为抗原,免疫6-8周龄Balb/c雌性小鼠,并通过细胞融合制备了能分泌抗胭脂鱼CD3ε的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3-E6B8、4-F6C11和3-G1E9。Western blotting结果显示:单克隆抗体4-F6C11可与胭脂鱼头肾、脾、肾蛋白提取液中分子量约为20KDa的蛋白发生特异性反应。免疫荧光结果显示单抗4-F6C11孵育过的胭脂鱼外周血白细胞中出现带有红色荧光的阳性信号。对一月龄胭脂鱼胸腺、脾和头肾进行免疫组化,结果显示与对照组相比,胸腺中出现黄棕色的阳性信号。本研究获得了胭脂鱼CD3ε全长cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。进行了表达模式探究,构建了载体并通过原核表达获得了重组目的蛋白,利用此重组蛋白免疫小鼠制备了相应抗体,并对该抗体进行了初步的检测,为进一步的认识胭脂鱼免疫系统,也为胭脂鱼病原体免疫检测提供有力工具,同时为胭脂鱼疾病防御、疫苗开发与应用奠定了理论基础。