登革病毒(dengue virus, DENV)属于黄病毒科(Flavivirade)黄病毒属(Flavivirus),主要的传播途径是通过蚊虫叮咬敏感的脊椎动物宿主。DENV根据血清抗原反应分可为四个血清型,分别为DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4型。各型病毒感染后均可引起的症状主要有登革热(dengue fever, DF)、登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome, DSS)。登革病毒的传播在早期较为局限,主要在热带和亚热带地区。但随着世界经济的一体化和各国之间的交流增强,登革病毒的传播范围日益扩大,目前在非洲、美洲、东南亚和西大平洋地区一百多个国家和地区均出现过登革病毒的流行。调查数据显示,全世界每年约有0.5-1亿人感染登革病毒,出现登革出血热症状的严重病例达50万人,2-2.5万人死亡,其中大多为儿童,死亡率为5%。因此,登革病毒的感染已成为全球重要的公共卫生问题,如何有效控制感染是解决这一问题的关键。人体在感染登革病毒后,可以无症状,也可只出现类似感冒症状,可自愈,稍重的是出现DF症状,这些病例主要出现在初次感染的患者,儿童患者多需要住院治疗。有相当部分二次感染的患者可以出现严重的病症DHF/DSS。目前还没有一个特异性的治疗方法,患者只能对症治疗,也缺乏有效的疫苗来防止感染。根据目前的研究结果显示,出现DHF和DSS的主要原因是抗体依赖增强(antibody-dependent inhancment, ADE)效应,而其根源是登革病毒存在四个不同的血清型。研究认为,病人感染其中一型病毒后,免疫系统会产生众多对各种血清型病毒有交叉反应的抗体,这些抗体短期内有一定的交叉保护性作用,但并不具有长期保护性作用。相反的,这些与其他血清型病毒有交叉反应性的非中和抗体或者是一些亚中和浓度抗体可能就是引起DHF/DSS的重要原因。这些抗体与病毒颗粒结构蛋白结合后,不能阻止病毒进入细胞,而其Fc部分会与某些细胞(如单核细胞或树突状细胞)膜上的Fc受体结合,这种结合有助于登革热病毒进入细胞,增强细胞对病毒的摄取及病毒在细胞内的复制,导致感染的增强,从而促使登革的严重疾病的发生。对于防止登革疾病传播的疫苗研发中,如果仅对一型病毒进行抗感染保护,会在病人感染异型病毒时,产生的ADE效应将会影响病人的生命。因此,各种类型的疫苗是否是引起ADE效应是登革防疫研究中一个关键点。登革病毒从首次分离至今,已有六十余年,但对其感染后疾病的防治还存在较大困难。其中的最大障碍是对登革病毒感染后的机体免疫机制不明,研究的针对性不能集中。登革病毒的基因组结构是单股正链RNA分子,长约11000nt,编码三个结构蛋白,分别为衣壳蛋白(C)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E),七个非结构蛋白(non-structure protein, NS),分别为NS1、NS2A、NS2B、 NS3、NS4A、NS4B和NS5。结构蛋白中的E蛋白与病毒感染有关,主要是与靶细胞表面的病毒受体结合,参与病毒与细胞之间的膜融合。在非结构蛋白中,虽然它们并不是成熟病毒颗粒的组成成份,但从目前的研究成果看来,它们在病毒感染与机体的免疫过程中起重要的作用。其中特别受到重视的是NS1蛋白,它是登革病毒中主要的非结构蛋白,通常有三个形式存在,一为分泌型,可以直接由感染的细胞分泌到胞外,可用于登革病毒早期诊断指标。二为胞内型,主要存在于细胞内生物腔膜上,三为膜型,存在于感染细胞膜上,它的功能推测可以通过细胞毒作用,直接参与病毒的清除,另外,也可能在病毒RNA的复制中起一定作用,但因为对其的蛋白结构未完成了解,与抗体的结合形式不清楚,所以其真正功能还需进一步研究。在抗原蛋白的结构未完全阐明之前,可以利用各种技术分析预测它们的二级结构,如冷冻电镜、酵母展示、点突变和多肽结合位点分析等。本研究利用合成的NS1重叠多肽与148株NS1单克隆抗体进行结合反应,可以得到单抗的线性结合位点。依据这些单抗的结合位点的特性,如一个单抗与多个位点结合,表明这些位点的物理位置是相近的,从而可以构建出NS1抗原蛋白的拓扑图。同时,我们也用流式细胞术,筛查各抗体与感染后细胞的表达的NS1蛋白抗原的结合类型,了解有哪些抗体是可以与感染细胞膜表面抗原进行结合的,从而可以为解释NS1蛋白在登革病毒感染免疫机制中的作用奠定基础。疫苗是一个有效预防感染性疾病的方式。如前所述,登革病毒存在四个不同的血清型,病人在二次感染异型病毒时,会产生严重的疾病,因此,疫苗的研制除了要有良好的中和保护作用外,还必须验证是否存在ADE效应。从目前的研究来看,无论是单一价的疫苗或多价疫苗,能同时符合这两个要求的疫苗还没有面世。在疫苗的研究中,中和实验是病毒研究中应用相当普遍的技术。传统的方法是蚀斑减少中和实验(plaque reducing neutralization test, PRNT),但这种方法费时费力,对结果的判断较为主观,许多研究者在开发一些可以替代它的方法。包括有基于流式细胞术的方法、基于ELISA技术的方法等。这些方法虽然是可以省时省力,但也存在一些问题,如病毒用量远比PRNT大。另外,在实际应用中,并不是所有的病毒特别是一些临床分离株,重复性较差。新近有研究者结合前期开发主要用于原位检测细胞因子分泌的技术----基于酶联免疫斑点分析(enzyme-linked immunospot-based microneutralization assay, ELISPOT)的微中和实验。本研究将从实际应用出发,建立和评价这一种技术,并应用这一方法检测临床收集的29例1型登革病毒感染患者恢复期血清的中和效价。本研究共分为如下三个部分：第一部分：分析登革病毒NS1抗体结合位点构建NS1拓扑图登革病毒NS1蛋白在登革病毒感染后免疫机制中的作用越来越受到重视,主要原因是它不是病毒颗粒的组成成份,可以避免引起ADE效应。它有多种表达形式,其中在感染细胞膜表面表达的部分,研究认为可能介导细胞杀伤功能而在病毒清除中起重要作用。研究结果显示,NS1蛋白应有三个区域,分别为RⅠ、RⅡ和RⅢ,但因其结构尚未解晰,对于它的真正分区功能未能从理论或实验中得到充分的证明。本研究合成DENV-1NS1的重叠多肽(每条多肽与上一多肽重叠5个氨基酸,最后一条重叠8个氨基酸,共35条),检测它们与148株NS1单克隆抗体的结合情况,分析它们的结合位点。检测结果表明,148株抗体中,有82株抗体可以与多肽进行结合,其中有七株抗体具有结合两个区域,具体为1A11A9、2E8A5与RI区的1肽和RⅡ22肽结合,6D14A4与RⅠ区的1肽、14肽和RⅡ区的22肽结合,1F32A1与RI区的1肽和RⅡ区的31肽结合,7E1A4和7E9A2与RI区的5肽和RⅢ区的27肽结合,1B7A1与RⅡ区的22肽和RⅢ区的32肽结合,三个区域相互之间有密切连接位点。利用以上多肽结合的位点,根据单抗结合位点在物理位置上的相近性,我们构建出NS1抗原蛋白的二级结构模拟图。另外,研究证明WNV的NS1抗体可以通过抗体依赖细胞杀伤功能对感染细胞进行吞噬清除,其基础是此抗体须与N在细胞表面表达NS1进行结合。我们用流式细胞术分析了以上148株抗体与感染病毒后细胞膜表面的NS1蛋白结合情况。结果显示,分别有92株、87株、75株和91株抗体与同型病毒感染后细胞膜表面的NS1蛋白结合。按照单抗与多肽的结合位点结果,针对RⅡ区结合的单抗,有82%(18/22)的抗体可以与DENV1-4任一型或多型病毒感染后细胞膜上抗原结合,而针对结合RI和RⅢ的抗体,分别有60%(29/48)和54%(6/11)的抗体可与膜抗原结合。这一结合模式可能与膜型NS1蛋白在感染细胞膜上嵌合形式有关。我们的研究结果与前期对黄病毒NS1的研究数据基本一致。这些数据可为研究NS1的功能和NS1抗体应用打下坚实基础。第二部分：酶联免疫斑点微中和实验方法检测登革病毒抗体中和活性方法的建立与评价目前中和实验的金标准方法是PRNT方法,这一方法在六孔板中进行,在病毒感染细胞后,需要在7-10天的时间孵育来形成可以用于检测的蚀斑。如果要完成大量的中和实验标本,这一方法将相当耗时而且结果判断主观性强。微中和实验是一个应用较多的高通量检测方法,这些实验是在96孔板中完成。本研究将评价一个新近开发的基于ELISPOT技术的微中和实验方法,并建立用于检测抗体或血清对登革病毒的中和活性的方法学。按照该法的基本原理是病毒感染细胞后,细胞表面可在较短时间内表达NS1蛋白,将细胞固定处理后,利用抗NS1的抗体可以建立ELISA检测方法,最后用固体原位显色方法可以通过斑点的形成指示病毒对细胞的感染情况。选用VERO E6细胞为病毒感染的靶细胞,通过对病毒加入量和登革各型病毒在感染后的孵育时间的条件优化,建立了ELISPOT方法检测登革各型病毒的方法学。方法学建立后,我们对33株抗登革病毒EDIII单克隆抗体针对四个血清型的中和活性检测,然后再从中选择十株单抗进行PRNT检测它们针对各型病毒的中和活性,两种检测方法应用相同病毒株、抗体稀释梯度进行,并对检测结果进行对比分析。结果显示,基于ELISPOT方法可以在96孔板中加入200PFUs病毒的情况下,形成的斑点清晰可辨,登革病毒四个血清型有不同的感染后孵育时间,DENV-1为4天,DENV-2和DENV-4为2天,DENV-3为3天。对比两种方法,它们之间的相关性较好,r=0.863,P<0.001；如果以PRNT方法为标准,我们将其结果与ELISPOT方法结果进行卡方检验(McNemar),结果显示ELISPOT与PRNT结果无显著性差别(P<1.000)。ELISPOT微中和实验检测这10株单抗针对四型登革病毒的中和效价的敏感性和特异性分别为95.6%(22/23)and88.24%(15/17)。如此可见,基于ELISPOT的微中和实验可以应用于四型登革病毒的中和活性实验检测,而且这种方法省时省力,适合进行批量筛查。第三部分Ⅰ型登革病毒感染患者康复期血清中和效价分析对登革病毒引起的疾病目前还未有特异高效的治疗方法或药物,因目前也没有一个能良好复制登革病毒感染后症状的动物模型,使疫苗的研制存在一定的困难。人体在自然感染登革病毒后,免疫状态的维持可以从一个侧面了解机体的抗病毒机制。本研究收集了29例在2006年感染1登革病毒的患者恢复期血清(2010年获取),利用本实验室建立和评价的ELISPOT微中和实验方法,检测它们针对四型登革病毒的中和效价,并对结果进行对比。结果显示,大部分血清对四型病毒有交叉中和活性,对四型登革病毒的中和效价(IC50,血清稀释度倒数)进行非参数检验(Kruska-Wallis H),结果显示,四组中和活性有显著性差异(X2=21.134,P<0.001),其中对同型(DENV-1)的中和活性最高,对DENV-4的中和活性最低。结果表明,机体在感染一种血清型病毒后,对四型病毒均有可能存在一定的四型交叉中和活性,但对同型病毒的中和活性强,而对其他型病的中和活性较弱。这些弱中和活性的交叉抗体,可能会在机体受二次异型病毒感染时引起ADE效应。小结：综上所述,本研究在以下方面取得成果：1、我们合成DENV-1NS1的重叠多肽35条,与148株NS1单克隆抗体进行结合,分析它们的结合位点,有七株抗体的结合位点在不同的两个区域,根据这些位点的物理位置相近性,成功构建出NS1蛋白抗原结构二级结构模拟图,结果与前期对黄病毒NS1蛋白的研究结果一致。研究结果可以在蛋白结晶之前增加对它基本结构的了解。我们还应用流式分析术,筛查了148株单抗与感染细胞膜型NS1抗原结合情况,得到抗体对各型病毒感染分泌于膜上NS1抗原的结合模式。结果显示,分别有92、87、75和91株抗体与同型病毒感染后细胞膜表面的NS1蛋白结合,针对RⅡ区结合的单抗,有82%的抗体可以与DENV1-4任一型或多型病毒感染后细胞膜上抗原结合(18/22),而针对结合RⅠ和RⅢ的抗体,有60%(29/48)和54%(6/11)的抗体可与膜抗原结合,这些结合模式可能与NS1蛋白在感染细胞膜上的嵌合模式有关。2、建立了基于ELISPOT技术的微中和实验方法检测平台,可以为登革病毒和其他相关病毒提供快速高通量的中和效价测定支撑。同时,我们也对此方法进行评价,对比PRNT方法,方法的特异性和敏感性高,与PRNT有良好的相关性,而且结果判断更加客观,非常适合批量处理的高通量检测实验。3、从29例1型病毒感染三年后的恢复期病人血清的中和活性检测结果中,获得了它们对同型和异型病毒的中和效价。通过统计分析,对同型病毒的中和活性远强于异型病毒的活性,这可以验证目前的有关初次感染后可以长期存在对同型病毒强的中和保护抗体而对异型病毒有弱中和抗体的理论。