乳腺癌是世界女性最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁女性的身体健康。随着生活环境、生活方式和膳食结构的改变,世界各地乳腺癌的发病率明显上升,并呈现出年轻化的趋势。在我国,女性乳腺癌发病率和死亡率也逐年升高,已成为威胁妇女生命和健康的头号杀手。为了便于疾病分类、指导诊治过程、评估和预测肿瘤的临床转归和结局,传统上常根据乳腺癌形态学将乳腺癌进行分类以便于区别。随着对乳腺癌研究的深入和现代技术方法的成熟,乳腺癌分类种类越来越多,分类标准越来越规范,对于乳腺癌研究和临床诊治帮助日益增大。乳腺癌具有高度异质性的特点,根据不同的标志可以将其分为不同的亚型。目前,以基因芯片技术为基础的分子分型是研究较多一种,其将乳腺癌分为5型：管腔A型(Luminal subtype A)、管腔B型(Luminal subtype B)、HER2过表达型(HER2over-expression subtype)、基底细胞样型(basal-like subtype)和正常乳腺样型(normal breast-like subtype)。除了分子分型外,根据ER、PR和Her-2的表达也可以对乳腺癌进行分型。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)是指不表达ER, PR和Her-2的特殊类型乳腺癌。基于乳腺癌高度异质性的特点,TNBC的生物学行为和临床表现同其它类型的乳腺癌存在较大差异。TNBC约占所有乳腺癌类型的9%-16%,年轻女性患者多见。TNBC的侵袭性较强,组织学分级高,易早期复发及远处转移,无病生存率和总生存率较低,预后比其他乳腺癌类型差。TNBC与basal-like亚型乳腺癌有较大程度的重合,约86.1%的TNBC符合basal-like乳腺癌分子亚型,而basal-like亚型乳腺癌中约67.6%为TNBC。因此,’TNBC常具有basal-like亚型乳腺癌某些表现,如侵袭性较强,核分裂相等级高,有丝分裂计数多等。目前,TNBC治疗方法包括手术治疗、化学治疗和放射治疗等,但是总的治疗效果欠佳。化疗作为治疗TNBC唯一的全身治疗方案,是TNBC治疗的基石。但“三阴性”的特点导致TNBC对内分泌治疗不敏感,且缺乏特异性的靶向治疗。而针对其他分子(如EGFR)的靶向治疗正在进行临床前研究或临床试验过程中,短期内投入临床广泛应用的可能性比较小。因此,寻找有效的治疗方法以降低TNBC的早期复发和远处转移,并增强TNBC对化疗的敏感性显得尤为重要。自噬是一个生理性的过程,在此过程中,细胞内容物和细胞器被双层膜结构包裹形成自噬小体而被运送到溶酶体进行降解和再利用。beclin1基因是第一个被发现哺乳动物细胞内的自噬相关基因,位于染色体17q21,与酵母细胞的自噬相关基因atg6同源。Beclin1的作用主要是通过与Vps34蛋白结合形成Ⅲ型PI3K复合体,参与自噬起始过程,促进自噬泡的形成。此外,Beclin1结构中含有BH3结构域,可以同Bcl-2蛋白家族抗凋亡蛋白成员Bcl-2、Bcl-xL结合而参与凋亡过程。Beclin1与Bcl-2、Bcl-xL蛋白结合可能并不能影响其抗凋亡作用,仅能影响Beclin1的自噬调控作用的发挥。beclin1基因被认为是一个肿瘤抑制基因,其杂合性缺失可导致细胞恶性转化。在对小鼠胚胎干细胞研究时发现,beclin1(-/-)的小鼠常常死于胚胎早期,而beclin1(+/-)的小鼠可存活,但是自发肿瘤发生率显著升高。在乳腺癌MCF-7细胞稳定转染beclin1基因可以导致细胞自噬增加,体外增殖能力和体内成瘤能力降低。除了在自噬中的作用,Beclin1还具有抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、停滞细胞周期及炎症扩散和预防细胞基因组突变等作用。此外,Beclin1和一些肿瘤相关信号通路如mTOR信号通路、PTEN信号通路和Rb信号通道等关系密切。在多种恶性肿瘤组织中,beclin1基因通常为低表达,而正常组织中则相对高表达。目前,对于beclin1在乳腺癌发生发展过程中的作用和地位仍存在争议。因此,一般将beclin1归为候选的肿瘤抑制基因,而相关研究仍在进行。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指在特定的生理或病理情况下,具有极性的上皮表型细胞向具有移行能力的间质表型细胞转化的现象。发生EMT的细胞粘附能力降低,迁移和侵袭能力增强,对凋亡抵抗性增强,并伴细胞外基质组分大量产生。从细胞水平来看,EMT发生仅表现为细胞形态简单的由上皮表型变成间质表型；在分子水平来看,该过程包含复杂的分子转化。EMT发生的标志包括上皮性标志分子E-cadherin表达降低和间质性标志N-cadherin、Vimentin、Snail等表达增高。EMT在在生理过程和病理性过程如肿瘤发生和进展等过程均具有重要作用。远处转移是恶性肿瘤的最重要生物学特征之一。临床上,大多数肿瘤患者并非死于原发性肿瘤而死于转移瘤。肿瘤组织中发生EMT的细胞数与肿瘤的侵袭和转移及复发显著相关。在乳腺癌尤其是TNBC的侵袭和转移过程中,EMT现象的发生也较普遍。约70%的原发性乳腺肿瘤中存在上皮性标志分子E-cadherin的表达减少甚至缺失,而乳腺癌循环肿瘤细胞主要呈现为间质表型。在TNBC中,E-cadherin表达显著降低,而间质标志N-cadhern、Vimentin、Snail等表达显著升高。EMT通过改变肿瘤细胞表型而增强肿瘤细胞的侵袭性和迁移能力,进而导致肿瘤复发和远处转移增加。EMT和自噬作为两种常见和重要的过程,在生理性和病理性情况下均具有重要作用。正是由于两者在肿瘤发生发展过程中的重要作用,越来越多的注意力正逐渐投入到两者联系和相互作用的研究中。Lv Q等研究DEDD对乳腺癌的作用时发现,DEDD可以逆转乳腺癌EMT过程,在此过程中自噬激活具有重要作用。进一步研究发现,DEDD通过与PI3K III/Beclin1自噬复合物相互作用,维持自噬复合体稳定性,进而激活自噬-溶酶体降解系统而增加EMT相关转录因子Snail的降解,从而抑制和逆转EMT进程。Peng Y等研究发现,抑制自噬可以通过降低肝癌细胞对失巢凋亡(anoikis)的抵抗性和肿瘤细胞肺内定植而显著抑制小鼠肝癌肺转移的发生,但抑制自噬并不能影响细胞侵袭能力、转移和EMT过程。Li J等发现,饥饿激发的自噬可以诱导肝癌细胞发生EMT而参与到肝癌细胞侵袭性调控,在此过程中TGF-β/Smad3信号通路的激活起到重要作用。Akalay I等发现,EMT可以使肿瘤细胞对细胞毒性T淋巴细胞诱导的细胞溶解抵抗,而自噬可能也参与该过程；抑制自噬可以使发生了EMT的肿瘤细胞恢复对细胞毒性T淋巴细胞诱导的细胞溶解的敏感性。因此,EMT和自噬关系及两者对肿瘤侵袭和转移的影响非常复杂,且在不同的肿瘤中两者的关系和作用也未必完全一致,这提示我们需要进一步加强在不同肿瘤尤其是乳腺癌中对两者的研究。此外,EMT和自噬除了在肿瘤侵袭和转移发挥作用外,在肿瘤其他方面也具有重要作用oMani等首先发现,发生EMT的乳腺癌细胞除了细胞表型改变外,乳腺癌干细胞比例也增多,从而证实EMT可诱导乳腺癌细胞发生干细胞化改变。这些现象也被多项研究所证实。一般认为,发生EMT的并且表达肿瘤干细胞标志物的基底样型乳腺癌更容易发生远处转移。在TNBC中,EMT能够促进TNBC中具有肿瘤干细胞表型的肿瘤细胞增加,而肿瘤干细胞表型增加是乳腺癌发生耐药、复发和转移的关键。此外,自噬同乳腺癌干细胞的维持也存在一定联系。因此,EMT和自噬可能参与乳腺癌肿瘤干细胞表型形成等过程,并对于乳腺癌耐药等具有重要作用。除了上述作用外,Beclin1在肿瘤耐药和调控化疗敏感性中具有重要作用。Beclin1在调控化疗敏感性的过程中,自噬依赖性和和自噬非依赖性机制均具有重要作用。在甲状腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌等恶性肿瘤中,Beclin1可通过增强化疗药物诱导的细胞凋亡或自噬性细胞死亡而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。但也有研究结果与此相悖。在胶质瘤中,敲除beclin1基因可以提高肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡的敏感性；在肝细胞癌中,索拉菲尼通过一系列作用下调Mcl1,导致Beclin1与Mcl1相互作用降低而释放,肿瘤细胞中Beclin1水平升高导致自噬激活增加,进而增强肿瘤细胞对索菲拉尼的抵抗性。因此,Beclin1对肿瘤化疗敏感性的影响仍存在较大争议,推测化疗药物类型、使用浓度和肿瘤类型等均可能此现象产生影响。本研究拟通过在三阴性乳腺癌BT-549细胞中过表达beclin1基因,观察Beclin1对TNBC的EMT过程和化疗敏感性等方面的影响,进而探讨通过Beclin1降低TNBC复发和转移及增强化疗敏感性的可能性。本实验共分二个部分：第一部分,构建稳定表达beclin1基因的三阴性乳腺癌BT-549细胞系,并研究Beclin1对BT-549细胞EMT过程的影响；第二部分,研究Beclin1对BT-549细胞对化疗药物5-FU和紫杉醇敏感性的影响,并探索相关的机制。第一部分beclin1对BT-549细胞的EMT过程的影响目的：构建稳定表达beclin1基因的三阴性乳腺癌BT-549细胞系,并研究Beclin1对BT-549细胞EMT过程的影响,并研究其对BT-549细胞侵袭性和迁移能力的影响。方法：通过慢病毒转染方法将pLenO-GTP-BECN1真核表达载体导入BT-549细胞构建稳定表达beclin1基因的BT-549细胞系,相同方法构建阴性对照组细胞,经荧光显微镜、real-time PCR和western blot鉴定细胞系为本实验所需；根据载体种类将BT-549细胞分为3组进行实验：pLenO-GTP-BECN1组(目的基因组)、pLenO-GTP组(阴性对照组)和未转染组(空白对照组)；transwell侵袭实验检测各组细胞侵袭能力；transwell迁移实验检测各组细胞迁移能力；real-time PCR和western blot分别检测各组细胞EMT上皮性标志分子E-cadherin和间质性标志分子N-cadherin、Vimentin、Snail表达情况。结果：慢病毒转染和嘌呤霉素筛选完成后,荧光显微镜下可见pLenO-GTP-BECN1组和pLenO-GTP组BT-549细胞GFP表达显著高于未转染组, real-time PCR和western blot结果显示pLenO-GTP-BECN1组Beclin1mRNA和蛋白表达显著高于其他两组(p<0.01),提示成功构建稳定表达beclin1基因的BT-549细胞系；transwell侵袭实验结果显示,pLenO-GTP-BECN组细胞穿过小室膜的细胞数显著低于其他两组(p<0.01),提示pLenO-GTP-BECN组细胞侵袭性显著降低；transwell迁移实验结果显示,pLenO-GTP-BECN组细胞迁移细胞数较其他两组显著降低(p<0.05),提示pLenO-GTP-BECN组细胞迁移能力显著降低；对于各组细胞EMT标志分子检测结果显示,pLenO-GTP-BECN1组细胞E-cadherin表达显著高于其他两组(p<0.05),而N-cadherin、Vimentin、Snail表达显著降低(p<0.05)。结论：Beclin1可逆转三阴性乳腺癌BT-549细胞EMT过程,并导致细胞侵袭性和迁移能力下降。第二部分beclin1对BT-549细胞化疗敏感性的影响目的：研究Beclin1对BT-549细胞对化疗药物5-FU和紫杉醇敏感性的影响,并探索相关的机制。方法：MTT实验检测不同浓度抗肿瘤药物分别作用一定时间对各组BT-549细胞的增殖抑制情况; Annexin V-APC/7-AAD法和Hoechst33342染色法检测50mg/ml5-FU和200μg/L紫杉醇分别处理48h后各组细胞凋亡情况；吖啶橙染色法检测50mg/ml5-FU和200μg/L紫杉醇分别处理48h后各组细胞内自噬性酸性囊泡形成情况；western blot检测50mg/ml5-FU和200μg/L紫杉醇分别处理48h后各组细胞的凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8和自噬相关蛋白LC3B表达情况。结果：MTT实验显示,分别接受5-FU和紫杉醇处理时,pLenO-GTP-BECN1组BT-549细胞增殖抑制率均显著高于其他两组(p<0.05)；Annexin V-APC/7-AAD法和Hoechst33342实验显示,化疗药物处理后pLenO-GTP-BECN1组细胞凋亡显著增加(p<0.05),细胞核出现凋亡性变化更明显；吖啶橙染色实验显示,化疗药物处理后pLenO-GTP-BECN1组细胞自噬激活现象较其他两组更明显；western blot实验结果显示,化疗药物处理后pLenO-GTP-BECN1组细胞Caspase-3、Caspase-8和LC3B蛋白表达均显著高于其他两组(p<0.05)。结论：Beclin1可显著提高三阴性乳腺癌BT-549细胞的化疗敏感性,而其中涉及的机制包括提高三阴性乳腺癌细胞对抗肿瘤药物诱导的凋亡的敏感性、激活过度自噬发生和逆转EMT过程等。