癌症是一个备受关切的问题,其被定义为恶性肿瘤或细胞生长失控。一般应用于癌细胞治疗的方法包括手术、放疗、化疗、光动力疗法等。这些方法的选择取决于肿瘤的不同时期和种类。然而他们都有不足之处,甚至会产生一定的副作用。因此,探索癌症治疗的新方法和技术手段是当前生物医学的研究热点和亟待解决的重大问题。声动力学疗法(SDT)是在光动力学疗法的理论与技术基础之上提出并发展的一种新型肿瘤治疗方法。SDT治疗是基于超声联合声敏剂(如,抗癌药物,化学药品)的声化学效应杀伤肿瘤细胞,即通过超声激活优先富集在肿瘤细胞中的声敏剂。越来越多的证据表明,SDT在肿瘤治疗中具有很大的潜力。已经表明,超声可以诱导一系列的细胞水平上的生物效应如导致细胞破坏,凋亡等。SDT处理肿瘤细胞导致细胞多种死亡途径。在过去的几十年中,诱导细胞凋亡是抗癌药物开发的主要考虑因素。然而,癌细胞触发多种途径逃避细胞凋亡。自噬是真核细胞中的降解过程,其导致细胞内物质在溶酶体中裂解。它可以由各种不同的压力环境刺激,包括外部的刺激(如缺氧,能量消耗,药物等),以及内部压力。由于细胞内部需要维持稳态,自噬对细胞生存,分化和发育是必不可少的。最近的研究表明,某些化疗药物诱导细胞凋亡的同时激活自噬。然而,根据不同的处理方式和细胞类型,细胞自噬不仅充当保护者防止细胞凋亡发生,而且也作为一个促进者促进细胞凋亡。本研究是在前期工作的基础上,以国家自然科学基金项目为依托,选用白血病典型细胞系K562和K562/DOX为研究对象,通过筛选SDT激活白血病细胞凋亡和自噬的最优实验参数组合,比较同一种细胞在SDT作用过程中所涉及的不同细胞死亡模式；重点研究SDT诱导白血病自噬的相关理化因子临界阂值、作用靶点、影响因素、细胞信号转导途径和关键基因调控；采用加入细胞自噬和凋亡的特异性药物抑制剂,并结合RNA干扰技术,探讨细胞自噬和细胞凋亡在SDT抗肿瘤效应中的主导地位以及二者之间的密切联系及相互作用机制；综合分析白血病细胞在SDT作用下产生的不同细胞死亡模式,充分发挥细胞自噬在抗癌研究中的优势,阐明SDT引发白血病细胞死亡模式的分子生物学机制。目前得到研究结果如下：1.PpIX在离体培养的K562细胞中的定量定位研究：实验通过流式细胞仪检测了PpIX在K562细胞中的代谢规律,结果表明,在相同孵育时间下,随着PpIX浓度的增加,细胞对其吸收量相应增加；同一药物浓度下,在与细胞孵育前2h内,随着孵育时间的延长,PpⅨ进入细胞中的含量也逐渐增多,当孵育时间超过2 h,各浓度组细胞内的PpⅨ含量基本不再增加或者增加缓慢,进入平台期,维持在一个相对稳定的状态。采用激光共聚焦显微镜结合特异性荧光探针研究了PpⅨ在K562细胞内的亚细胞定位,结果表明,PpⅨ在K562细胞内主要定位于线粒体和部分定位于溶酶体。实验结果提示,2h可能是随后进行超声处理的最佳PpⅨ孵育时间；PpⅨ在K562细胞中的分布提示线粒体和溶酶体可能是SDT损伤的主要靶位点之一。2.SDT诱导人白血病细胞K562的不同死亡模式及机制研究。实验以人白血病细胞K562为研究模型,通过形态学观察、生化分析和分子检测等鉴定细胞自噬和凋亡的典型特征,然后通过抑制剂实验检测细胞自噬与细胞凋亡、细胞存活之间的关系,最后对SDT作用的可能机制进行探讨。其主要研究结果如下：①流式细胞仪分别结合Annexin V-PE/7-AAD荧光双染实验发现,SDT诱导细胞发生凋亡。PI冻染结合流式细胞仪分析显示,SDT作用细胞后,出现DNA断片,而单纯PpⅨ和单纯超声对K562细胞核没有明显的影响。凋亡抑制剂z-VAD-FMK能引起PpIX-SDT诱导的K562细胞存活率的升高和凋亡率的下降；此外,凋亡相关蛋白Cyto c从线粒体转定位至细胞质,Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达发现,SDT处理后0.5 h,细胞中Bcl-2和Bax的比值较对照组降低,4h达最低,提示SDT处理激活了K562细胞线粒体凋亡通路。②基因转染及激光共聚焦显微镜检测SDT处理后,eGFP-LC3转染的K562细胞中出现更多的绿色荧光聚集,提示LC3蛋白发生重分布参与自噬。Western blotting检测自噬体标志蛋白LC3-Ⅱ提示细胞自噬活性依赖于SDT处理后的孵育时间,最短检测到自噬发生时间是超声处理后0.5 h,且随孵育时间延迟自噬现象减弱。同时荧光显微镜观察到,SDT处理后K562细胞AO染色成阳性细胞明显增多。激光共聚焦显微镜观察到LC3和溶酶体标志蛋白Lamp2共定位,进一步证实了SDT处理后自噬溶酶体的形成。抑制剂实验表明SDT诱导细胞内AVOs的形成发生在凋亡的早期。③采用扫描电子显微镜观察到SDT处理K562细胞后,细胞表面的超微结构发生了明显变化并且被自噬抑制剂3-MA或Ba A1增强。进一步实验表明,自噬抑制剂3-MA或Ba A1增强了SDT诱导的细胞存活率的下降和细胞凋亡率的升高；荧光显微镜结合DAPI染色显示,自噬抑制剂3-MA或Ba A1明显增加SDT诱导的染色质固缩。自噬抑制剂Ba A1进一步增强SDT诱导的caspase-3PARP的剪切。这些数据表明,SDT处理联合细胞自噬抑制剂可以增强SDT抗癌疗效。④ROS在SDT诱导细胞凋亡和自噬效应中的调控作用。SDT处理后K562细胞内ROS显著升高,ROS清除剂NAC有效缓解了SDT诱导的细胞膜的损伤及细胞内ROS水平的升高,同时可以部分解除SDT诱导的细胞凋亡以及PARP的活化,提示细胞内ROS水平与细胞凋亡有关；通过MDC和AO染色发现,ROS清除剂NAC的加入,几乎完全抑制了SDT诱导的K562细胞的自噬现象。此外,NAC抑制LC3和LAMP2的共定位及Beclin 1的表达,从而表明细胞内ROS水平与细胞自噬活性变化也有一定的关系。3Beclin1在PpIX-SDT诱导K562细胞自噬及凋亡中的作用。为了进一步研究SDT诱导的细胞自噬和凋亡之间的关系,实验从Beclin 1干扰这种途径,通过viacount检测细胞存活,荧光显微镜结合DAPI染色检测细胞核染色质,Annexin V-PE/7-AAD检测细胞凋亡,MDC染色检测细胞自噬,Western Blotting检测自噬及凋亡相关蛋白表达等实验检测SDT处理前抑制Beclin 1表达后对细胞的影响。结果显示采用shRNA Beclin 1抑制Beclin 1表达后,SDT处理后细胞MDC阳性绿色荧光明显降低,LC3-II转化减少；shRNA Beclin 1可增强由SDT引起的DAPI荧光染色和细胞凋亡率及Caspase-3的活化。实验结果表明抑制Beclin 1表达明显加强了SDT处理后细胞的凋亡,且自噬的增强起到保护细胞的作用。4. PpIX-SDT对K562细胞Bcr-Abl磷酸化的影响。首先我们使用克隆形成法检测了SDT对K562细胞增殖的影响,应用Western Blotting检测Bcr-Abl蛋白表达变化。结果表明,对照组相比,SDT处理组显著抑制K562细胞增殖,且BCR-ABL的磷酸化水平于实验后0.5 h明显降低。抑制剂实验表明,采用AP24534抑制Bcr-Abl表达后,SDT处理后细胞毒性增强。实验结果表明Bcr-Abl在K562细胞死亡中起着很关键的作用。5. PpIX-SDT增强阿霉素对人K562/DOX细胞的抗癌效应。实验首先检测了单独超声对K562/DOX细胞的增殖抑制作用,超声强度对K562/DOX细胞的相对存活率有一定的强度依赖性,超声强度越强,其对细胞的损伤越明显,1W的超声强度对K562/DOX细胞的损伤不明显。随后检测了1W超声强度结合不同浓度PpIX对K562/DOX细胞的杀伤作用。结果表明,细胞的相对存活率随着PpIX浓度的增大而下降。然后将重点研究不同浓度DOX联合1 W超声和2μg/ml PpIX对K562/DOX细胞的增殖抑制作用,DOX联合PpIX-SDT后,对K562/DOX细胞的毒性作用明显增强,其中DOX浓度为100 ng/ml时,和2μg/ml PpIX及1W超声的联合指数(CIs)最高。这些结果表明,PpIX-US参数优化有效地提高阿霉素的细胞毒性。流式细胞仪结合Annexin V-PE/7-AAD双染实验发现PpIX-SDT联合阿霉素作用于K562/DOX细胞后,凋亡率增强,且DNA片段化实验检测发现,联合疗法对细胞DNA的损伤比单独用药的作用显著。PpIX-SDT联合阿霉素组的活性氧产量与其余各组相比明显升高。表明活性氧可能参与了PpIX-SDT联合阿霉素杀伤细胞的过程。并且,PpIX-SDT联合阿霉素能显著下调K562/DOX细胞中P-gp的表达,这表明PpIX-SD T联合DOX处理可能影响膜药物外排泵。这些结果表明,PpIX-SDT联合阿霉素杀伤K562/DOX耐药细胞其分子机制可能归因于P-gp的表达下降增加DOX在K562/DOX细胞内的浓度。