研究背景生物标志物是存在于血液、其他体液中,反映正常或异常组织生理或疾病状态下的生物分子,可用于亚临床疾病的早期检测、急慢性综合征的诊断、危险因素分层、疾病进展的监测及诊疗选择和/或疗效评估等方面。大规模人类蛋白质组比较研究表明,从健康到疾病的进展过程中往往伴随着循环系统和/或受累组织中蛋白表达的复杂改变。常规蛋白类生物标志物的检测采用的是免疫测定法,其中,早期应用最为普遍的免疫测定方法是酶联免疫吸附法。然而,对于某些出现紧急情况(如,胸痛、呼吸困难或其他严重医疗情况以及外伤患者)的患者来说,开发便携式、成本低的定量检测蛋白类生物标志物的方法具有重要意义。床旁检测(POCT)是一种利用便携式分析仪和快速诊断试剂盒进行实时检测的方法,这种方法的所有检测可在医院检验科或临床实验中心等实验室以外的地方进行。调查结果显示,临床上急需发展这种检测方法。POCT为日益微型化的仪器设备和程序提供了便利,其主要优势在于不需要将标本送至实验室,也不需要经标本的前处理,且可获得快速的床旁检测结果,这种时间上的优势为紧急诊断和治疗提供了便利。免疫胶体金标记技术、生物芯片和生物传感器技术是POCT的三大理论基础。在免疫测定领域,POCT的最佳应用是心肌损伤指标的检测,因为有一半的胸痛患者必须借助血清学指标检测才可获得早期确诊,试剂主要采用胶体金免疫层析试条。生物传感器领域最成熟的POCT检测设备为便携式血糖仪的应用,其出现一方面是出于糖尿病患者家庭护理的需要,另一个重要的原因是由于生物传感技术及丝网印刷技术的进步,从而使这种检测设备应运而生。生物传感器作为一门涉及化学、生物学、物理学以及电子学等领域的交叉学科,且集高效、灵敏、特异、小巧、经济等优点于一身,目前已成为生命科学领域的研究热点。它利用各种类型的换能器,将待测的生物信号转换为电、声、光等可检测的物理信号,从而实现对样本中靶生物分子的检测。用于生物传感器的检测技术包括荧光技术、石英晶体微天平、电化学发光、表面等离子共振光谱和电化学方法等。在这些方法中,电化学方法因受环境干扰少、信号检测简单、仪器成本低等优点而引起了人们的广泛关注。葡萄糖传感器是电化学生物传感器领域研究最多、商品化最早的生物传感器。葡萄糖生物传感器的发展主要基于两方面的技术基础：第一,葡萄糖是动植物体内碳水化合物的重要组成部分,葡萄糖的定量测定在生物化学、临床化学和食品分析中都占有很重要的位置,其分析方法的研究一直引起人们的关注,特别是临床检验中对血糖分析的需求,促进了葡萄糖酶分析方法的建立；第二,1954年,Clark建立了氧电极分析方法。1956年又对极谱式氧电极进行了重大改进,使活体组织氧分压的无损测量成为可能,并首次提出了氧电极与酶的电化学反应理论。根据Clark电极理论,自20世纪60年代开始,各国科学家纷纷开始葡萄糖传感器的研究。经过半个世纪的努力,葡萄糖传感器的研究和应用已有了很大的发展,在食品分析、发酵控制、临床检验等方面发挥着重要的作用。自1994年丝网印刷传感器用于葡萄糖的监测的商业化生产以来,在过去的19年里大约有10家公司致力于这种仪器及葡萄糖试纸的制造和市场营销,随着微电子工业的快速发展,使血糖仪不断朝着多功能化、便携、操作简单、成本低的方向发展。目前,市售的便携式血糖仪只需1μL标本,5秒就能完成检测,这种标本用量少的快速方法正是临床检测所需要的。研究目的结合蛋白类生物标志物检测的需要及便携式血糖仪的检测优点,以如何将便携式血糖仪与经典的酶联免疫法相结合用于蛋白类生物标志物的检测为主要研究内容,将糖化酶(glucoamylase)作为葡萄糖和蛋白类生物标志物之间重要的连接物,初步建立一种基于葡萄糖检测的电化学免疫分析方法,为利用便携式血糖仪进行蛋白类生物标志物的POCT检测提供新思路。研究方法本研究以经典的免疫学理论为基础,首次采用糖化酶作为检测抗体的酶标记物,利用商品化的便携式血糖仪作为免疫反应信号检测设备,设计和构建了一种基于葡萄糖检测的免疫分析法,试图建立一种新的快速、灵敏、准确的免疫检测方法。研究内容主要包括以下两个方面：1.基于葡萄糖测定的电化学免疫分析方法的建立及其初步评价1.1检测体系的构建：以甲胎蛋白作为模型分析物,免疫反应在商品化的酶标板中进行,采用夹心免疫模式,将AuNPs标记的生物标记物Ab2/glucoamylase/AuNPs作为酶标抗体。酶标抗体通过将抗-甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)抗体和糖化酶加入AuNPs溶液中,将糖化酶和抗-AFP同时标记到该纳米粒子表面,制备得到Ab2/glucoamylase/AuNPs生物标记物。夹心免疫反应后,向酶标板中加入淀粉,在AFP存在的条件下,结合在酶标板上的免疫复合物中的糖化酶水解底物淀粉,产生葡萄糖。将上述溶液加入丝网印刷电极上检测,葡萄糖传感器的制备是通过将葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GOD)和电子媒介体K3[Fe(CN)6]加入待测液中,利用葡萄糖传感器测定夹心免疫复合物中糖化酶催化淀粉产生的葡萄糖的量,进而通过葡萄糖的检测对免疫分析物进行定量检测。1.2实验条件的优化：对制备二抗探针的pH值、Ab2与糖化酶比例及二抗孵育时间进行优化。1.3二抗探针的表征及该方法的性能评价：二抗探针进行透射电镜扫描,观察标记前后纳米粒子的结构性质；利用紫外-可见吸收光谱对标记过程进行表征。对该方法的线性范围、特异性及重复性等性能进行评价。2.基于血糖仪检测的酶联免疫分析方法的构建2.1底物的预处理及其处理条件的优化：配制20mg mL-1的淀粉溶液,加热煮沸30分钟制成糊化淀粉,在加至酶标板之前,往溶液中加入耐热α-淀粉酶制成液化淀粉。在已建立的葡萄糖-电化学免疫分析法的基础上,通过耐热α-淀粉酶和糖化酶双酶水解的方法提高糖化酶水解淀粉的速率,最终实现以便携式血糖仪作为检测设备的目标。研究糖化酶水解淀粉的最佳液化温度、液化时间、底物浓度、糖化温度、pH值。2.2糖化酶与葡萄糖之间线性关系的研究：配制不同浓度糖化酶,往淀粉溶液中加入各不同浓度糖化酶,用血糖仪检测水解产生的葡萄糖的量。2.3检测方法：以甲胎蛋白作为目标检测物,在商品化的酶标板中进行免疫反应,采用双抗夹心ELISA法,检测抗体为通过戊二醛交联法制备的糖化酶标记抗体；往酶标板中加入液化淀粉后,在耐热a-淀粉酶和糖化酶的协同水解作用下产生葡萄糖；利用血糖仪检测由糖化酶水解产生的葡萄糖的含量,最终通过葡萄糖的量计算出待测物质AFP的浓度。2.4性能评价：对该方法的线性范围、抗干扰及血糖仪重复性进行评价。实验结果1.利用透射电镜对纳米金及其标记蛋白后的纳米金生物标记物进行表征,纳米金的大小约50nm,标记蛋白后,在纳米金的周围可见一层电子密度较低的阴影。同时,还通过考马斯亮蓝染色和紫外-可见光谱对标记过程进行表征,结果符合实验设想。2.以AFP作为模型分析物,成功构建了基于葡萄糖检测的电化学免疫分析方法。该方法的检测信号——葡萄糖的浓度,与检测物质的浓度相关,随着AFP浓度的增加,得到的葡萄糖的浓度越大,在0.5-100ng mL-1范围内AFP具有良好的检测线性。3.由于纳米金的信号放大作用,提高了该免疫分析方法的灵敏度,且AuNPs/anti-AFP可批量制备,直接在酶标板内形成夹心免疫复合物,无需复杂的电极修饰过程,有望应用于临床肿瘤标志物的检测。4.糖化酶直接水解淀粉反应产生的葡萄糖的量与糖化酶的浓度在10ng mL-1-0.125μg mL-1范围内呈线性关系。5.用血糖仪检测同一浓度的葡萄糖溶液,同一批次血糖试纸的CV为2.0%,不同批次之间血糖试纸的CV为3.4%,表明血糖试纸的重复性较理想。6.AFP浓度为0.1-100ng mE-1时,血糖仪检测到的葡萄糖的量与AFP的浓度呈线性关系。结论1.首次采用糖化酶作为检测抗体的酶标记物,将蛋白类生物标志物的检测通过经典的酶联免疫法与葡萄糖浓度的检测联系起来,成功构建了基于葡萄糖检测的电化学免疫分析方法,有望为临床上检测蛋白类生物标志物提供新的检测方法。本研究成果为进一步实现传感器检测系统的产品化展示了广阔的应用前景。2.通过对淀粉进行预处理后,提高了糖化酶水解淀粉的效率,并验证了糖化酶水解淀粉产生的葡萄糖的量与糖化酶的浓度在一定范围内呈线性关系。将预处理后的淀粉作为酶联免疫反应的底物,在AFP浓度为0.1～100ng mE-1范围内,AFP的浓度与葡萄糖的量呈线性关系,并在血糖仪检测范围内,成功实现了利用便携式血糖仪进行蛋白标志物检测的目的。