一株固氮菌的分离鉴定及菌藻共处固氮机理的研究

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为了筛选高效固氮菌并探讨菌-藻共处条件下的固氮机理,本实验从生长在黄河三角洲盐碱地的野生大豆根瘤菌内分离、筛选出一株高效自生固氮菌,命名为SKDGD-10。首先,通过在无氮固体培养基中生长计数,初步确定其具有固氮能力。进一步测定菌株SKDGD-10的固氮能力,结果发现在无氮液体培养基中的氨氮、亚硝态氮和硝态氮的量分别为0.5404ug/mL、0.00568ug/mL和0.703ug/mL,总固氮量达到1.25 ug/mL。通过土壤固氮实验,发现菌株SKDGD-10能将土壤的全氮量由0.05%提高到0.12%(总氮/土壤:m/m)。以34F和491R作为引物,对菌株SKDGD-10的nifH基因进行PCR扩增,扩增出460bp左右的特异性目标条带,从分子水平上证明了菌株SKDGD-10具有固氮基因。通过菌落性状、生理生化性状、扫描电子显微镜、16S rDNA和系统分类学位置等分析,初步确定筛选出的菌株SKDGD-10属于肠杆菌属。  菌-藻共处固氮机理的研究通过设计三种处理方式完成:处理1,菌株SKDGD-10单独培养;处理2,菌株SKDGD-10和蛋白核小球藻A共培养;处理3,蛋白核小球藻A单独培养。通过测定三种处理方式初始和结束时总氮的含量,结果表明:处理2中菌株的固氮量是处理1的1.52倍,证明了菌-藻共培养提高了菌株SKDGD-10的固氮能力。为了进一步分析菌-藻共处对固氮影响的机理,本研究从菌-藻数量、叶绿素含量、溶解氧、反应体系中pH、以及代谢产物五个方面进行了分析:通过相差显微镜观察三种处理方式中菌株SKDGD-10和蛋白核小球藻A的数量,发现处理2中菌株SKDGD-10的数量多于处理1,处理2中蛋白核小球藻A的数量多于处理3,证明了菌-藻共培养促进了菌株SKDGD-10和蛋白核小球藻A的生长;通过测定处理2和处理3中叶绿素的含量,发现培养84h时处理2中叶绿素的含量达到12.9mg/L,处理3中叶绿素含量只有3.3mg/L,证明了菌-藻共培养促进了蛋白核小球藻 A的生长;通过便携式溶氧仪测定溶解氧,处理1中的溶解氧持续下降至0.2mg/L,达到厌氧状态,处理3内的溶解氧持续上升至20mg/L,体系2内溶解氧持续维持在0.5mg/L左右的低氧状态,证明了菌-藻共培养为菌株 SKDGD-10提供了固氮最适的低氧环境;通过测定反应体系中 pH值,处理1中的pH持续下降至7.2,处理3中的pH持续上升至10.85,处理2中的pH上升并维持在9.2左右,证明了菌-藻共培养满足了菌株最适生长pH为9.0左右的条件;通过高效液相色谱仪(HPLC)测定三种处理方式中的甲酸、乙酸含量,三种处理方式中均没有检测到甲酸,处理1中检测到乙酸,处理2和处理3中均没有检测到乙酸,证明了乙酸作为一种碳源物质被菌株SKDGD-10利用。综上,本研究证明了菌-藻共处提高了菌对氮气的固定能力。
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