几丁质是海洋中最丰富的生物质资源,其在自然界中以结晶形式存在。尽管全球水生环境中每年会产生超过1011吨的几丁质,但是海洋沉积物中几丁质的积累量很少,表明海洋微生物在海洋几丁质的降解和再循环中发挥着重要的作用。但是,到目前为止,海洋微生物降解几丁质的机制还不是完全清楚。近年来,裂解多糖单加氧酶（lytic polysaccharide monooxygenases,LPMOs）驱动的氧化降解被发现在天然的结晶几丁质降解过程中发挥重要作用。目前已报道的具有几丁质降解活性的LPMOs均只能氧化几丁质的C1位原子生成末端为N-乙酰-D-葡萄糖酸内酯（2-（acetylamino）-2-deoxy-D-gluconic acid,GlcNAc1A）的氧化性几丁寡糖。迄今为止,关于细菌（陆源和海洋细菌）如何利用和吸收几丁质的氧化降解产物至今仍未有研究。并且,氧化降解在海洋几丁质的微生物降解中的贡献也不清楚。假交替单胞菌（Pseudoalteromonas）是一类广泛分布于全球海洋环境中的海洋特有菌群。目前已报道的具有几丁质降解能力的假交替单胞菌至少含有一个由3个基因组成的几丁质降解保守基因簇（chitin degradation cluster,CDC）,该基因簇编码两个GH18家族的几丁质酶和一个AA10家族的LPMO。LPMO存在于目前已报道的所有具有几丁质降解活性的假交替单胞菌中,表明氧化降解在假交替单胞菌对海洋几丁质的降解中发挥重要作用。因此,我们推测在假交替单胞菌中可能存在一个几丁质氧化降解的完整代谢通路。Pseudoalteromonas prydzensis ACAM 620是分离自南极海冰的几丁质降解菌株,其基因组中只含有一个位于CDC基因簇上的lpmo基因。本文我们选择菌株ACAM 620作为实验菌株探究海洋细菌中LPMO驱动的几丁质氧化降解及其代谢通路。本论文首先对菌株ACAM 620中AA10家族的LPMO的功能进行了鉴定与表征。然后通过比较转录组、体内遗传学实验以及体外生化实验阐明了菌株ACAM 620中LPMO驱动的几丁质氧化降解的完整代谢通路及其调控机制。最后研究了几丁质氧化降解通路在细菌中的分布及其生态功能。研究结果揭示了几丁质降解的新途径,并将为阐明氧化降解在海洋几丁质降解中的作用与机制提供重要依据。本论文取得的研究成果如下:一、海洋假交替单胞菌中胞外降解几丁质的单加氧酶LPMO的鉴定与表征宏基因组和基因组分析表明,海洋环境中具有潜在几丁质降解活性的LPMOs绝大多数属于AA10家族,且主要分布在γ-变形菌纲。在属水平上,来自γ-变形菌纲的弧菌属和假交替单胞菌属中有相当高比例的细菌含有AA10家族LPMOs,揭示出弧菌和假交替单胞菌是含有AA10家族LPMOs的代表性海洋细菌类群,因而成为研究海洋几丁质氧化降解的良好菌株来源。基于此,我们选取了假交替单胞菌来开展海洋几丁质的氧化降解研究。实验室前期获得了 13株不同种的假交替单胞菌的典型菌株和6株假交替单胞菌的非典型菌株,这19株菌均具有胶体几丁质降解能力,且其基因组均含有至少一个CDC基因簇。到目前为止,来自海洋细菌的LPMOs极少被表征。系统发育分析表明,假交替单胞菌等海洋细菌来源的AA10家族的LPMOs与已报道的陆源生物来源的具有几丁质降解活性的LPMOs分别独立聚簇,且二者间的序列一致性（20%-34%）很低。为了揭示假交替单胞菌中AA10家族的LPMO在海洋几丁质降解中的作用,我们对其中的一株假交替单胞菌ACAM 620在以胶体几丁质为唯一碳源生长时的胞外蛋白质组进行定量检测,检测到菌株ACAM 620的分泌组中含有较高丰度的LPMO蛋白,这表明LPMO在菌株ACAM 620降解胞外几丁质的过程中发挥重要作用。为了进一步确认该LPMO蛋白的功能,对其进行异源表达和分离纯化,并对其降解结晶几丁质的产物进行了鉴定。Q-TOF-MS分析表明,类似于已报道的具有几丁质降解活性的LPMOs,在存在外源电子供体抗坏血酸的情况下,来自假交替单胞菌菌株ACAM 620的LPMO能利用O2或H2O2作为共底物特异性的氧化降解α-或β-几丁质中β-1,4糖苷键上的C1位碳原子并产生末端为GlcNAc1A的氧化性几丁寡糖。二、海洋细菌P.prydzensis ACAM 620中参与代谢氧化性几丁寡糖的关键基因簇的鉴定随后,我们比较了这19株具有胶体几丁质降解活性的假交替单胞菌对单糖N-乙酰-D-葡糖胺（N-acetyl-D-glucosamine GlcNAc,GlcNAc1A）和葡萄糖酸内酯（D-gluconate）的利用能力。实验结果表明,所有的假交替单胞菌均能利用几丁质的水解产物——GlcNAc作为唯一碳源进行生长,仅有9株菌（包括菌株ACAM 620）能利用几丁质的氧化降解产物——GlcNAc1A为唯一碳源生长,表明在这些能利用GlcNAc1A的假交替单胞菌中可能存在几丁质氧化降解的完整通路。但是,所有的假交替单胞菌均不能利用GlcNAc1A的结构类似物——D-葡萄糖酸盐（D-gluconate）为唯一碳源生长,进一步表明在这些能利用GlcNAc1A的假交替单胞菌中GlcNAc1A应该不会被代谢成D-gluconate。为了揭示假交替单胞菌中参与代谢氧化性几丁寡糖的关键基因,我们选取了能高效利用GlcNAc1A的假交替单胞菌ACAM 620作为模式菌株开展了不同碳源培养条件下的比较转录组分析。转录组分析表明,当菌株ACAM 620以GlcNAc1A为唯一碳源生长时,其基因组中一个未曾被表征的由8个基因组成的基因簇中的基因均有显著的上调表达,且该基因簇受几丁质的诱导表达。该基因簇编码两个转运蛋白OngOT-1和OngIT、一个调控蛋白OngR、一个β-己糖胺酶OngA、一个糖激酶KdgK、一个RidA家族蛋白OngD、一个潜在的D-氨基酸脱乙酰酶OngB和一个潜在的D-氨基酸脱氨酶OngC。并且,该基因簇仅存在于能利用GlcNAc1A的假交替单胞菌中。因此,我们推测该基因簇可能参与菌株ACAM 620对几丁质的氧化降解产物——氧化性几丁寡糖或GlcNAc1A的代谢。为了进一步明确该基因簇在几丁质降解中的作用,我们对其上携带的5个酶基因（ongA、ongB、ongC、ongD和kdgK）分别进行了基因敲除,发现敲除株均丧失了利用GlcNAc-GlcNAc1A或GlcNAc1A的能力,而回补株则又都获得了与野生株相似的利用能力,揭示出这些酶基因是菌株ACAM 620利用氧化性几丁二糖或GlcNAc1A所必需的。上述研究结果证实了该基因簇是菌株ACAM 620代谢氧化性几丁寡糖的关键基因簇,我们将其命名为ONG基因簇。三、海洋细菌P.prydzensis ACAM620中参与代谢氧化性几丁寡糖的关键酶的功能分析体内遗传学实验证实了 ONG基因簇上携带的酶基因（ongA、ongB、ongC、ongD和kdgK）是菌株ACAM 620利用氧化性几丁寡糖所必需的。为了进一步探究这些酶基因是如何参与氧化性几丁寡糖代谢的,我们分别对其进行了异源表达和分离纯化,并对其参与的催化反应进行了研究。该基因簇编码一个GH20家族的β-己糖胺酶OngA。系统发育分析表明,OngA及其同源蛋白（来自不同细菌的ONG基因簇）独立于已表征的GH20家族β-N-乙酰葡糖氨酶单独聚簇,表明OngA及其同源蛋白可能在底物选择性上不同于报道的GH20家族β-N-乙酰葡糖氨酶。到目前为止,催化氧化性几丁寡糖水解产生单糖的酶蛋白还未被报道,我们推测很可能是OngA催化了该反应。体外酶活检测和酶解产物分析证实了 OngA能够水解氧化性几丁二糖释放出单糖GlcNAc和GlcNAc 1A。SignalP5.0和PSORTb3.0预测结果表明,OngA含有N端信号肽,且位于周质空间。基于此,我们推测OngA很可能在周质空间水解氧化性几丁寡糖产生单糖GlcNAc1A和GlcNAc。除OngA外,ONG基因簇还编码4个胞内酶,包括1个糖激酶（KdgK）、1个RidA家族蛋白（OngD）、1个潜在的D-氨基酸脱乙酰酶（OngB）和1个潜在的D-氨基酸脱氨酶（OngC）,我们推测这些酶蛋白很可能参与了 GlcNAc1A的分解代谢。为了阐明菌株ACAM 620中GlcNAc 1A的胞内代谢途径,我们首先检测了糖激酶KdgK对GlcNAc 1A的活性。在以GlcNAc1A为底物的反应体系中加入大量的KdgK蛋白,发现只有少量磷酸化的GlcNAc1A生成。并且,向上述反应体系中继续添加OngB、OngC和OngD三种酶中的任何一种,均未检测到乙酸或伯胺的产生,这表明KdgK不是第一个参与GlcNAc1A代谢的酶。因此,我们推测GlcNAc1A的胞内代谢途径可能不同于其他已报道的糖类物质的代谢而更加类似于氨基酸类物质的代谢,GlcNAc1A胞内代谢的第一步反应很可能是直接脱乙酰而非磷酸化。因此,我们分别检测了重组蛋白OngB、OngC和OngD对GlcNAc1A的脱乙酰活性,发现只有OngB对GlcNAc1A具有活性。Q-TOF-MS分析还揭示出OngB降解GlcNAc1A的另一个产物是脱乙酰化的GlcNAc1A（2-（amino）-2-deoxy-D-gluconic acid,GlcN1A）,进一步证实了 OngB 是菌株 ACAM 620 胞内代谢GlcNAc1A的第一个关键酶,能够将GlcNAc1A脱乙酰化产生GlcN1A和乙酸。进一步的体外酶活检测及酶解产物分析还揭示出,OngC是菌株ACAM 620胞内代谢GlcNAc1A的第二个关键酶,能够将GlcN1A脱氨基生成2-酮-3-脱氧-葡萄糖酸（2-keto-3-deoxy-D-gluconate,KDG）和 NH3;KdgK 是菌株 ACAM620 胞内代谢 GlcNAc1A的第三个关键酶,能够将KDG磷酸化产生KDG-6-P。在系统发育上,参与GlcNAc1A分解代谢的关键酶OngB和OngC与参与氨基酸分解代谢的酶蛋白更相似,而与参与GlcNAc分解代谢的酶类不相似。上述研究揭示出氧化性单糖GlcNAc1A的分解代谢采用了类似于N-乙酰-D-氨基酸的分解代谢方式,而与其他糖类的分解代谢不相似。四、海洋细菌P.prydzensis ACAM620中参与几丁质氧化降解的关键转运蛋白和关键调控蛋白的鉴定到目前为止,氧化性几丁寡糖是如何被细菌吸收的还不清楚。菌株ACAM 620的ONG基因簇编码一个外膜TonB依赖的转运蛋白（TonB-dependent receptors,TBDRs）OngOT-1,且在ONG基因簇外还存在一个OngOT-1的同源蛋白（OngOT-2）。ongOT-1和ongOT-2基因均受到GlcNAc1A的显著诱导表达,且OngOT-1和OngOT-2蛋白都在菌株ACAM 620以胶体几丁质为唯一碳源生长时的分泌组中被检测到,据此我们推测这两个TBDRs转运蛋白可能参与了氧化性几丁寡糖的跨膜转运。为了研究这两个转运蛋白在几丁质利用中的作用,我们对菌株ACAM 620中这两个蛋白的编码基因进行了基因敲除,构建了双基因敲除株（ΔongOT-1/ΔongOT-2）,发现敲除株丧失了利用氧化性二糖的能力,而向敲除株回补ongOT-1和ongOT-2中的任一基因都能使菌株恢复利用氧化性二糖的能力,表明OngOT-1和OngOT-2是菌株ACAM 620从胞外吸收氧化性几丁寡糖的关键外膜转运蛋白。前面的研究揭示出,β-己糖胺酶OngA能够水解周质空间内的氧化性几丁寡糖释放出单糖GlcNAc1A和GlcNAc,那么产生的氧化性单糖GlcNAc1A是如何被转运至胞内的呢?菌株ACAM 620的ONG基因簇还编码一个内膜钠-溶质共转运蛋白家族（sodium solute symporterfamily,SSS）转运蛋白OngIT。基因敲除并结合生长实验表明OngIT是菌株ACAM 620将GlcNAc1A从周质空间转运至胞内的关键内膜转运蛋白。此外,菌株ACAM620的ONG基因簇还编码了一个MurR/RpiR家族转录调控蛋白OngR。与野生株ACAM 620相比,基因敲除株（ΔongR）在以GlcNAc1A为唯一碳源的培养基中生长的更好,表明OngR是一个负调控蛋白。为了揭示OngR调控的操纵子,我们通过实时定量PCR（RT-qPCR）对ΔongR敲除株以GlcNAc1A、GlcNAc和葡萄糖等单糖为唯一碳源生长时细胞中ONG基因簇中的基因以及ongOT-2和lpmo的转录水平进行定量分析,并与野生型菌株中的基因表达水平进行了比较。结果表明,不管以哪种单糖为碳源,野生株和敲除株中的基因ongIT、kdgk、ongA、ongOT-2和lpmo的转录水平均没有明显变化。但是,在菌体生长延迟期,野生株中的ongOT-1、ongC、ongB和ongD基因的转录水平被强烈抑制,而在菌体生长指数期受GlcNAc1A的强烈诱导。并且,在ΔongR中,ongOT-1、ongC、ongB和ongD的转录表达水平不受碳源种类的影响。上述结果表明OngR通过抑制操纵子ongOT-1和ongCRBD的转录来调控菌株ACAM 620对GlcNAc1A的分解代谢。五、海洋细菌中几丁质氧化降解通路的阐明及其普遍性分析基于上述研究,我们阐明了菌株ACAM 620中几丁质的氧化降解完整通路及其调控机制,该通路主要包含五个过程:1)胞外大分子几丁质在LPMO及几丁质酶ChiA和ChiC的协同作用下被降解生成小分子的氧化性几丁寡糖;2)氧化性几丁寡糖经外膜转运蛋白OngOT-1和OngOT-2转运至周质空间;3)己糖胺酶OngA水解周质空间内的氧化性几丁寡糖生成GlcNAc1A和GlcNAc;4)内膜转运蛋白将GlcNAc1A转运至细胞质;5)GlcNAc1A在胞内依次在脱乙酰酶OngB、脱氨酶OngC以及糖激酶KdgK的作用下生成KDG-6-P。菌株ACAM 620的基因组还编码两个潜在的KDG-6-P醛缩酶,我们推测生成的KDG-6-P很可能在醛缩酶的作用下进一步被代谢成甘油醛-3-P和丙酮酸,从而最终进入糖酵解途径。此外,OngR主要通过抑制操纵子ongOT-1和ongCRBD的转录来调控菌株ACAM 620的几丁质氧化降解通路。为了揭示海洋细菌中几丁质氧降解通路的生态学意义,我们对lpmo以及ONG基因簇在海洋细菌中的分布进行了分析。结果表明,在2455个可培养海洋细菌中有298个海洋细菌同时含有lpmo和ONG基因簇,且都分布在γ-变形菌纲,尤其是弧菌属和假交替假单胞菌属。在陆源细菌中,同时含有lpmo和ONG基因簇的细菌也主要分布在Y-变形菌纲。除ongOT-1基因外,ONG基因簇中的其他基因在这些细菌中均高度保守,表明几丁质氧化降解途径在细菌中是保守的。此外,同时含有lpmo和ONG基因簇的海洋假交替单胞菌比不含ONG基因簇的菌株具有更强的天然结晶几丁质降解能力,并且含有lpmo和ONG基因簇的海洋弧菌也具有结晶几丁质降解能力,这表明具有完整的几丁质氧化降解通路的细菌类群在海洋环境中几丁质颗粒的初始降解中发挥重要作用。我们的研究有助于阐明氧化降解在海洋几丁质降解中的贡献。