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胰腺癌（pancreatic cancer）是恶性程度极高、预后极差的实体肿瘤之一,5年生存率低于5%,目前常用的肿瘤治疗方案（如手术、放疗、化疗和免疫治疗等）都没有令人满意的疗效,亦缺乏有效的分子靶向治疗方案。理解胰腺癌的发生发展机制,对于进一步开发或改进治疗方法具有重要意义。白介素-6（interleukin6 IL-6）是一个重要的促炎因子,编码基因位于7号染色体短臂15.3区域（Chr-7p15.3）。研究表明IL-6在多种肿瘤,包括胰腺癌中高表达,IL-6在胰腺癌的发生发展、血管形成、炎症微环境及转移中发挥着重要作用,可能与患者预后相关,但IL-6高表达的分子调控机制还有待深入研究。第一部分 IL-6在胰腺癌组织及细胞中的表达及其临床意义目的初步研究IL-6在胰腺癌组织及胰腺癌细胞中的表达水平;分析胰腺癌组织中IL-6表达与胰腺癌患者临床病理因素之间的相关性,并进一步分析IL-6表达水平与胰腺癌患者预后的关系。方法1、通过生物学信息分析技术,分析胰腺癌在内的多种肿瘤中IL-6-mRNA的表达水平、胰腺癌组织中IL-6-mRNA的表达水平及其与胰腺癌患者预后之间的相关性;2、采用实时荧光定量PCR技术（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测人胰腺导管上皮细胞（HPDE6-C7）及四种胰腺癌细胞（人原位胰腺腺癌细胞BXPC-3、人转移胰腺腺癌细胞ASPC-1、人胰腺导管癌细胞MIAPaCa-2和CFPAC-1）中IL-6-mRNA的表达水平;3、免疫组织化学技术检测68例胰腺癌患者术后石蜡切片标本及33例癌旁组织石蜡切片标本中IL-6蛋白的表达,并分析其与患者临床病理因素之间的关系;随访胰腺癌患者生存资料,采用Kaplan-Meier分析绘制生存曲线,分析IL-6表达与患者生存率的相关性。结果1、根据TCGA数据库中31种肿瘤IL-6-mRNA结果分析发现:胰腺癌、食管癌、胶质母细胞瘤等肿瘤中IL-6-mRNA表达水平显著高于相应对照组织;比较179例胰腺癌组织和171例对照癌旁组织的IL-6-mRNA结果显示:胰腺癌组织中IL-6-mRNA的表达较癌旁组织显著升高,且IL-6的高表达与患者的预后成负相关（P＜0.05）;2、qRT-PCR结果显示:与人胰腺导管上皮细胞（HPDE6-C7）相比,四种胰腺癌细胞的IL-6-mRNA表达均明显升高（P＜0.05）;3、免疫组化染色结果提示:在胰腺癌细胞中IL-6阳性信号主要位于细胞质中,在胰腺癌组织中IL-6蛋白高表达率为33/68（48.5%）,在癌旁组织中IL-6蛋白高表达率为8/33（24.2%）,差异有统计学意义（P＜0.05）;并且IL-6的表达与胰腺癌分化程度、淋巴结转移相关,而和性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、肿瘤位置及是否神经浸润无明显相关性;IL-6表达水平与胰腺癌患者总体生存率成负相关。结论1、胰腺癌细胞及组织中IL-6高表达,并且胰腺癌组织中IL-6表达水平与胰腺癌分化程度、淋巴结转移相关;2、胰腺癌中IL-6表达水平可以作为判断胰腺癌预后的一个指标。第二部分 胰腺癌细胞IL-6表达的分子调控机制研究及超级增强子的功能初探目的初步探讨胰腺癌细胞IL-6的高表达是否由于超级增强子的活化;并初步探讨超级增强子的功能。方法1、通过生物信息学分析技术,结合H3K27ac CHIP-Seq数据,分析胰腺癌细胞IL-6基因周边是否存在H3K27ac富集区域（即超级增强子区域）;2、将超级增强子抑制剂JQ-1（选择0.5μmol/L和1μmol/L两个浓度）及I-BET-762（选择1μmol/L和2μmol/L两个浓度）作用于胰腺癌细胞（MIAPaCa-2、CFPAC-1）,利用qRT-PCR技术检测其IL-6-mRNA表达水平的变化、细胞免疫荧光检测MIAPaCa-2细胞IL-6蛋白的表达差异;采用细胞划痕实验检测超级增强子抑制剂作用前后MIAPaCa-2细胞迁移能力的变化;3、运用CRISPR-Cas9基因编辑技术,根据数据库中推测的超级增强子所在位置设计合成sgRNA引物序列,构建质粒分别转染入MIAPaCa-2及CFPAC-1细胞,药筛后构建超级增强子敲除的稳转细胞系;利用Genotyping和DNA测序技术验证目的序列是否敲除成功;qRT-PCR检测超级增强子序列敲除后胰腺癌细胞IL-6-mRNA表达水平的变化;采用细胞划痕实验及克隆形成实验检测超级增强子序列敲除前后MIAPaCa-2细胞迁移能力和克隆形成能力的变化。结果1、生物信息数据显示:胰腺癌细胞IL-6基因上游,在Chr7:22615000-Chr7:22630000位置有大量的H3K27ac富集,通过其乙酰化程度及富集强度,推测为超级增强子区域;2、超级增强子抑制剂JQ-1及I-BET-762作用于CFPAC-1及MIAPaCa-2细胞后,其IL-6基因的mRNA表达水平显著下降（P＜0.05）,两种浓度的作用效应无明显统计学差异;MIAPaCa-2细胞中IL-6的免疫荧光强度在JQ-1和I-BET-762作用后明显减弱、其细胞迁移能力在超级增强子抑制剂作用后也明显受抑制（P＜0.05）;3、在MIAPaCa-2细胞中,成功转染sgRNA-Cas9质粒,构建了靶向序列IL-6-SE1（Chr7:22615000-Chr7:22619000）和 IL-6-SE2（Chr7:22625000-Chr7:22630000）敲除的细胞系,genotyping证实了这两段序列的敲除、DNA测序结果显示剪接后的新的DNA序列成功连接;分别敲除IL-6-SE1和IL-6-SE2后,MIAPaCa-2细胞IL-6-mRNA 表达均显著下降（P＜0.05）;IL-6-SE1 和 IL-6-SE2 敲除后,MIAPaCa-2细胞迁移能力和克隆形成能力明显受抑制（P＜0.05）。结论1、胰腺癌细胞中IL-6-mRNA的表达变化受超级增强子调控;2、IL-6-SE1和IL-6-SE2是调控胰腺癌细胞IL-6-mRNA表达的关键超级增强子;3、IL-6-SE1和IL-6-SE2能调控胰腺癌细胞的迁移能力及克隆形成能力,可能是具有潜在应用价值的胰腺癌的治疗靶点。