研究背景随着20世纪中期现代工业化进程的到来,呼吸道过敏原种类也渐渐增多,人类的保健负担进一步加重。根据WHO的统计,全球有将近30亿人患有哮喘,哮喘的全球发病率每十年增加将近50%。当呼吸道过敏性疾病的发病率在发达国家中趋于稳定,其在发展中国家的发病率仍在不断升高。支气管哮喘的特点是慢性气道炎症,涉及Ⅰ型速发型变态反应和Ⅳ型迟发型变态反应。较统一的观点认为哮喘是多种细胞如上皮细胞、成纤维细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞引起的慢性气道炎症。支气管痉挛、黏膜水肿、黏液分泌物充满气道是哮喘患者急性发作的一个重要环节。对CD4+ T淋巴细胞在哮喘的发生、发展中的作用已经有深入的认识,而对于哮喘中CD8+ T细胞的作用,目前尚未清楚。T辅助细胞(Th)特别是T辅助细胞1(Thl)和T辅助细胞2(Th2)之间功能平衡的破坏在哮喘的发病中发挥了重要作用,Th2功能增强、Thl功能抑制可导致哮喘的发生。哮喘动物模型研究及临床哮喘研究都已发现,在哮喘发病时,支气管肺泡灌洗液(BALF)及肺组织中Th2型细胞因子(IL-4,IL-5、IL-13)的水平有所升高。在迟发型哮喘反应中,Th2细胞通过IL-4、IL-5、IL-13等激活嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞等,促进气道炎症反应,哮喘发病涉及大约50多种炎症介质和25种以上细胞因子,构成了炎性细胞相互作用的复杂网络。其特点是T细胞调控,非IgE依赖,与T细胞免疫应答有关。CD8+T细胞是形式及作用多样化的细胞群体,可产生Thl和Th2型细胞因子。动物研究不仅发现CD8+T细胞通过诱导树突状细胞产生的IL-12和IL-18,在调节IgE的产生上发挥作用,还发现抗原致敏过程中,局部淋巴结的CD8+T细胞可诱导及调节Th2分化。虽然CD8’T细胞有着上述对机体的有益作用,但是在肺部,CD8+T细胞的作用仍然不清楚。临床上,CD8+T细胞在哮喘中的作用几乎完全被认为是有害的,更说明在疾病中,这些细胞仍对机体存在一定的不利影响。因此,无论是在抗原致敏前的调节效应的加强,还是通过其抑制促炎作用,都证明了CD8+T细胞是哮喘发病中非常有价值的治疗靶点。有关CD8+调节T细胞(regulatory T cells,Treg)的抗原特异性研究尚处于起步阶段。目前研究发现：CD8+ Treg调节T细胞可分为天然和获得性两大类。天然的CD8+ Treg主要包括天然存在的CD8+CD25+胸腺细胞、CD8+ CD122+ Treg和CD8+ CD45RClow Treg。而获得性CD8+ Treg包括在体外诱导的CD8+ CD28-Treg.DC2诱导的CD8+Treg和CD8+CD25+Treg,以及在体内诱导的CD8+ CD75s+Treg、CD8+CD45RC high Tcl Treg和TCR肽特异性的CD8αα+ Treg等。目前已知获得性CD8+Treg具有较明确的抗原特异性,其识别的抗原主要是诱导所用抗原、效应T细胞上的分子如TCR、IL-2R等。但对于天然存在的CD8+Treg识别的靶抗原还不清楚。CD8+Tr细胞中主要的细胞表型为CD8+CD28-,现在的某些研究认为,CD8+T细胞中,CD28表达的缺失是反映CD8+T淋巴细胞细胞复制衰竭的标志。我们的研究主要通过建立哮喘小鼠模型,分析、对比哮喘模型小鼠及对照组小鼠脾、肺组织CD8+T细胞分泌的三种重要细胞因子IL-4、IL-10.IFN-γ水平,最后,对CD8+调节T细胞中重要的细胞亚型CD8+CD28+细胞进行增殖研究,探索CD8+T细胞在哮喘发病中的作用机制。第一部分小鼠哮喘模型的建立目的探讨建立OVA致敏和激发的雌性BALB/c小鼠哮喘模型。方法SPF级雌性BALB/c小鼠(南方医科大学实验动物中心)20只,4-6周龄,体重18-20g,随机分为2组,每组10只,A组为正常对照组,B组为哮喘模型组。B组小鼠于实验流程第0、14d给予腹腔注射含OVA 2mg和乳化的氢氧化铝5mg的生理盐水混悬液200μl致敏；第21d开始先给予4%OVA生理盐水200μl滴鼻激发,随后给予4%OVA生理盐水雾化液40ml经超声雾化器雾化吸入,每天1次,每次持续约40min,连续7d。A组以生理盐水代替致敏液及雾化液,方法同B组。在末次激发48h后,采用无创肺阻抗法,通过小鼠肺功能仪测定小鼠的气道反应性。连接好Buxco无创肺功能仪并设定标准值,将自然生理状态下的BALB/c小鼠置入无创动物肺功能仪体描箱,开始的1min内记录小鼠气道反应性的基础值；随后给予300μl生理盐水雾化1min,然后再测定浓度递增的乙酰甲胆碱(Mch；3.12、6.25、12.50、25.00、50.00mg／m1)雾化激发小鼠气道阻力的变化,每次雾化1min,记录3min。气道反应性即是以小鼠在NS激发下的增强的呼吸间歇(以下简称Penh值)为基准,其中Penh=(呼气峰流速／吸气峰流速)×呼气间歇。肺功能结束24h后,摘取小鼠眼球放血后将其颈椎脱臼处死,两组小鼠各随机选取6只行支气管肺泡灌洗术。将回收的BALF涂片,固定,HE染色,光学显微镜下进行细胞总数和分类的计数。细胞分类至少计数400个细胞,求出各类细胞所占百分比。两组小鼠各各随机选取4只行开胸取肺组织,置于10%中性甲醛固定液中固定。常规取材、脱水、石蜡包埋、制备石蜡切片、HE染色。中性树胶封片,光学显微镜下观察组织形态、气道上皮损伤、气管及血管周围嗜酸性粒细胞浸润情况,拍片。结果1.致敏、激发过程小鼠行为学观察：模型组小鼠出现不同程度的扭体反应、立毛,头面部瘙痒,前肢搔鼻,烦躁不安,然后俯伏不动,口唇紫绀,呼吸急促,腹肌抽搐,二便失禁等症状；而正常组小鼠无此阳性症状。2. BALF中细胞总数和分类比较：①BALF细胞总数：A组BALF细胞总数为(0.62±0.43)×105／ml,B组BALF细胞总数为(1.41±0.13)×105／ml,B组BALF细胞总数显著高于A组(t=-14.152,P<0.01)。②BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分率：A组BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分率分别为0.83%1.14%和5.87%±1.42%,B组BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分率分别为和26.42%±4.08%和32.63%±4.93%,B组BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分率显著高于A组(t=-14.259,t=-11.479,P<0.01)。3.肺功能检查：生理盐水与3.12mg/ml Mch激发后,两组小鼠的Penh值均无统计学差异(t=-0.714,t=-1.678,P>0.05)。但随着Mch浓度逐渐增加(6.25、12.50、25.00、50.00mg／ml),哮喘组Penh值也逐渐增加,于≥6.25mg/ml Mch激发与对照组比较均有统计学差异(P<0.01)。证明哮喘组小鼠存在气道高反应性表现,模型建立成功。析因设计结果显示：不同的吸入Mch浓度之间存在显著差异(F=180.605,P<0.01),不同组别之间也存在显著差异(F=209.375,P<0.01),组别与不同Mch浓度存在显著的交互效应(F=54.297,P<0.01)。4.肺组织病理观察结果：哮喘模型组支气管及血管周围大量炎性细胞浸润,肺间质及肺泡腔内可见中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润,气道上皮损伤,结构紊乱,气道内杯状细胞肥大增生,气道内分泌大量黏液并有粘液栓形成,粘膜下胶原纤维沉积。对照组肺组织气道结构清晰,气道纤毛上皮排列整齐,无明显的炎症改变及胶原纤维沉积。结论雌性BALB/c小鼠经OVA和乳化的氢氧化铝腹腔注射致敏后,采用滴鼻联合雾化激发的方法成功建立小鼠哮喘模型,更加符合哮喘气道的病理生理改变。第二部分CD8+T细胞在哮喘发病中作用机制的研究目的初步检测IL-4、IL-10及IFN-γ在哮喘及对照组小鼠肺、脾中的表达情况,探索CD8+T细胞在哮喘发病中的作用机制。方法32只SPF级雌性BALB/c小鼠随机平均分为2组,每组16只,A组为正常对照组,B组为哮喘模型组。哮喘模型的制作方法及过程同第一部分内容。观察2组小鼠BALF中细胞比例变化和气道病理改变。无菌操作台取小鼠脾脏、肺脏,于尼龙网上研磨成匀浆状态,制成单细胞悬液,随后通过MiniMACS免疫磁珠纯化柱分别进行阳性分选,纯化其中的CD8+T细胞,流式检测提示纯度大于95%。将纯化后的CD8+T细胞用PBS重悬,调整浓度为2×105／孔加入24孔板培养,每孔加入OVA(50μg/ml)刺激,将24孔板置于5%C02、37℃孵育箱中培养,96h后取细胞培养上清液,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分别检测两组小鼠脾、肺组织内CD8+T细胞IFN-γ、IL-4和IL-10细胞因子的分泌情况。结果哮喘组小鼠无创肺功能测试证明哮喘组小鼠存在气道高反应性表现,模型建立成功。BALF细胞总数和中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞百分率均显著高于对照组(P<0.01)。病理观察可见哮喘组小鼠的气道炎症以中性粒细胞及嗜酸性粒细胞浸润为主,而对照组无此变化。哮喘组脾组织CD8+T细胞分泌的IFN-y水平(4997.05±189.07pg/ml)较对照组(4509.73±378.10pg/ml)显著增加(t=-3.261,P<0.01),肺组织CD8+T细胞分泌的IFN-y(237.30±36.96pg/ml)较对照组(429.70±19.98pg/ml)显著降低(t=-12.951,P<0.01)。哮喘组脾组织CD8+T细胞分泌的IL-4较对照组无显著差异(P>0.05),而哮喘组肺组织CD8+T细胞分泌的IL-4(203.20±16.59pg/ml)与对照组(3.29±1.61pg/ml)相比显著增加(t=33.918,P<0.01)。哮喘组小鼠肺、脾组织CD8+T细胞产生的IL-10水平(分别为265.24±36.98、22.49±6.69pg／ml)较对照组(14.42±4.41 pg/ml、5.82±3.24pg/ml)均有显著增加(t=19.047,t=6.340,P<0.01)。哮喘组小鼠肺、脾的三种细胞因子分泌水平之间均存在显著差异(P<0.01)。结论CD8+T细胞通过分泌不同作用的细胞因子参与哮喘的发生及发展,不同器官的CD8+T细胞在哮喘的发病中有着各自不同的作用特点,可能与其独特的迁移行为、局部细胞分化等因素有关。第三部分CD8+调节T细胞增殖研究目的初步检测小鼠脾脏淋巴细胞及CD8+CD28-T淋巴细胞的增殖情况。方法6只SPF级雌性BALB/c小鼠(南方医科大学实验动物中心)6只。断颈处死健康小鼠,浸入75%乙醇后,于超净台取出脾脏,于尼龙网上研磨成匀浆状态,后制成单细胞悬液。将细胞悬液离心洗涤后,得到淋巴细胞。用预热的PBS/0.1%BSA稀释,每毫升细胞悬液加入1.5μl CFSE贮存液进行细胞CFSE染色。处理后的小鼠脾脏细胞悬液分别加入24孔培养板内培养(浓度为1×106／m1),每孔200μl,并设立实验组和对照组各2组。于细胞培养第0天于每孔加PHA 6μg/ml,第3天洗涤离心,新鲜完全培养基重悬细胞(浓度为1×106／ml),加入24孔板。每孔内加入IL-250U/ml。37℃,5%CO2避光培养2天。结果通过PHA、rIL-2刺激淋巴细胞,小鼠脾脏淋巴细胞及CD8+CD28- T淋巴细胞亚型的均发生了不同程度的分裂增殖情况。结论小鼠的CD8+CD28- T细胞在丝裂原刺激后,至少有部分细胞仍有完整的分裂能力。CD28的缺乏并不完全意味着CD8+T细胞失去增殖的能力。