【摘 要】
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目的 白血病是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤。抗白血病疗法一般旨在消灭处于增殖期的细胞,但像正常及白血病造血干细胞这样较少处于增殖状态的细胞便能抵抗这种治疗,所以,
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目的 白血病是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤。抗白血病疗法一般旨在消灭处于增殖期的细胞,但像正常及白血病造血干细胞这样较少处于增殖状态的细胞便能抵抗这种治疗,所以,白血病造血干细胞特异基因靶点的识别,特别是决定其自我更新基因靶点的识别,便有可能把白血病阻止在其源头,为白血病治疗提供新的手段。Bmi-1对于正常和白血病造血干细胞的自我更新至关重要,白血病造血干细胞或祖细胞如果缺乏 Bmi-1 会产生明显的增殖障碍,这使得 Bmi-1 基因可能成为治疗白血病的靶点。本研究通过构建反义 Bmi-1 的真核表达载体并转染 K562 细胞,目的在于使其产生的反义 mRNA 封闭 K562细胞中 Bmi-1 的表达,以观察其对 K562 细胞生长的抑制作用及其对细胞周期、p16 蛋白表达的影响,从而探讨反义 Bmi-1 抑制白血病细胞增殖的作用机理,为白血病的治疗提供新的思路。 方法 1. 根据 Bmi-1 基因已知序列设计合成一对引物,上下游引物分别加入 XhoI 和 ClaI 的酶切位点,用反转录 PCR(RT-PCR)方法从人红白血病细胞株(K562)总 RNA 中扩增编码 Bmi-1 的基因片段,插入克隆载体 pMD18-T,构建 pMD18-Bmi-1 载体,经 XhoI,ClaI 双酶切出 Bmi-1 基因片段,并将该片段克隆至载体 pLNCX2 中构建pLNCX2-Bmi-1 真核表达载体。2. 以 pLNCX2-Bmi-1 为模板,选择Bmi-1 基因起始密码子及编码环指结构的核苷酸片段,反向连接于pLNCX2 质粒上得到反义 Bmi-1 表达质粒。3. 在体外转染中通过脂质体法将质粒导入 K562 细胞中,以 G418 进行筛选得到阳性克隆。4. 以
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