[目的]　　 钩虫抗凝肽是近年来从吸血寄生线虫-钩虫体内分离得到的具有显著抗凝血活性的一类多肽，临床前实验及部分临床试验表明钩虫抗凝肽具有活性好、特异性强、副作用小等优点，预示钩虫抗凝肽可能开发成为抗凝抗栓新药，具有广阔的应用前景。　　 AduNAP4是本实验室前期从十二指肠钩虫中发现的一种新的钩虫抗凝肽。为了进一步了解此抗凝肽，阐明其抗凝作用机制，本实验对其进行了生物信息学分析，并在原核表达系统大肠杆菌中表达其融合蛋白，测定了重组融合蛋白AduNAP4的体外抗凝活性及其对丝氨酸蛋白酶、凝血因子的抑制作用，为进一步将该抗凝肽开发成新型抗凝抗栓药物奠定基础。　　 [方法]　　 1.十二指肠钩虫抗凝肽AduNAP4的生物信息学分析　　 运用生物信息学网站及相关软件对AduNAP4进行理化性质预测、二级结构预测、功能域搜索、氨基酸序列相似性比较及进化树构建。　　 2.十二指肠钩虫抗凝肽AduNAP4的原核表达、纯化及抗凝活性检测　　 构建重组表达质粒pET-32a/AduNAP4，转化大肠杆菌BL21(DE3)，利用IPTG诱导目的蛋白表达，SDS-PAGE分析表达情况。　　 重组表达产物经Ni-IDA亲和层析纯化后，用凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)检测其体外抗凝活性。　　 3.十二指肠钩虫抗凝肽AduNAP4抑制作用机制的测定　　 利用发色底物法测定rAduNAP4对丝氨酸蛋白酶、凝血因子的抑制作用，用软件分析计算Ki值并判断其抑制类型。　　 [结果]　　 1.十二指肠钩虫抗凝肽AduNAP4的生物信息学分析　　 AduNAP4的eDNA序列编码104个氨基酸，含一段由23个氨基酸残基组成的信号肽。AduNAP4成熟肽含81个氨基酸残基，其分子量大小为9437.7Da，等电点为4.67。AduNAP4与现有的一些钩虫抗凝肽氨基酸序列相似性分别为：50.0％(AcAP5)、49.4％(AceAP1)、47.9％(AcAP6)、33.8％(AcAPc2)、33.3％(AcAPc3)、31.6％(AcAPc4)。　　 2.十二指肠钩虫抗凝肽AduNAP4的原核表达、纯化及抗凝活性检测　　 用IPTG能诱导重组融合蛋白AduNAP4在大肠杆菌中高效表达，表达产物主要以可溶形式存在。纯化的AduNAP4具有显著的抗凝活性，其延长两倍PT和.APTT的浓度分别为154.9 nM、23.1 nM。　　 3.十二指肠钩虫抗凝肽AduNAP4抑制作用机制的测定　　 AduNAP4对fⅩa和fⅪa均有较强抑制活性，其对fⅩa的Ki值为7.34±1.74nM，属于fⅩa的混合型抑制剂；其对fⅪa的Ki值为42.45±3.25nM，属于fⅪa的竞争性抑制剂。AduNAP4对凝血酶、激肽释放酶、fⅫ及fⅦa/TF复合物没有抑制作用。　　 [结论]　　 AduNAP4与AcAPc2、AcAP5等钩虫抗凝肽的氨基酸序列相似性≤50％，其重组融合蛋白在大肠杆菌中可得到高效的可溶性表达。体外抗凝实验表明AduNAP4具有显著的抗凝血活性，其延长aPTT比延长PT更有效；作用机制检测表明AduNAP4对fⅩa及fⅪa均具有较强抑制作用。由于fⅪa在凝血过程中起到反馈放大、持续促进凝血酶生成的重要作用，因此，fⅪa可能是抗凝抗栓药物开发的新靶标。AduNAP4作为迄今为止首个报道的对fⅪa有明显抑制作用的天然抗凝物质，可能开发成为新型抗凝抗栓药物，具有广阔的应用前景。