【摘 要】
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为了研究缺失里氏木霉中内源表达量最高的两种纤维二糖水解酶(CBHⅠ, CBHⅡ)或进一步敲除转录抑制因子Crel是否有助于提高重组甘露聚糖酶的表达水平,本文在里氏木霉中建立了
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为了研究缺失里氏木霉中内源表达量最高的两种纤维二糖水解酶(CBHⅠ, CBHⅡ)或进一步敲除转录抑制因子Crel是否有助于提高重组甘露聚糖酶的表达水平,本文在里氏木霉中建立了一种快速的双基因同步定点整合的体系,即以里氏木霉自身甘露聚糖酶基因(man5A)为重组表达的报告基因,通过一步转化,将该基因定点整合入纤维二糖水解酶I(cbhl)基因位点,同时缺失主要的两个纤维素酶基因(cbhl、cbh2),得到重组工程菌TrMan12。本研究中还构建了一株cbhl基因单敲除并利用cbhl启动子在cbhl位点表达man5A基因的重组工程菌TrMan11,并且在双基因敲除的重组工程菌TrMan12基础上进一步将转录抑制因子Cre1进行敲除,从而获得cbh1,cbh2,cre1三个基因同时缺失的重组工程菌TrMan13.将这三株改造获得的重组工程菌株与出发菌株Tu6Aku70进行摇瓶发酵,结果显示,重组工程株TrMan11的甘露聚糖酶产量比出发菌株提高7倍,TrMan12则提高了10倍。而纤维素酶产量和胞外总蛋白分泌水平有不同程度的降低。Real-Time PCR检测甘露聚糖酶基因(man5A)的转录水平,发现三株重组工程菌较出发菌株有不同程度的提高。本文在里氏木霉中首次报道了通过一步转化实现两个基因同步定点整合的方法,并同时对主要的纤维二糖水解酶及转录调控因子进行敲除,对利用基因工程手段构建高效表达重组蛋白的里氏木霉工程菌株具有一定的指导意义。
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