阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是最常见的神经退行性疾病,p-淀粉样蛋白(Beta-amyloid protein, Aβ)的过度积累,导致神经元丢失、认知功能障碍,是阿尔茨海默病的主要病因。然而,我们对其神经毒性机制的认识是非常有限的。最近的研究表明,无论在AD模型还是细胞培养方面,均提示Aβ结合受体介导了其主要的神经毒性作用。阿尔茨海默病患者最典型的病理特征包括老年斑(Senile plaques, SP)与神经元纤维缠结(Neurofibrillary tangles, NFTs),主要由Aβ、tau蛋白构成。越来越多的证据表明,Aβ的过度产生和随之出现的淀粉样斑块,显著减少新生神经元的存活,在阿尔茨海默病的发病机制中扮演重要的角色。大多数哺乳动物包括人类,海马齿状回(Dentate Gyrus, DG)的成熟神经元是通过干细胞的增殖、迁移和分化产生的子细胞进而发展形成的。新生颗粒神经元突触融入海马CA3区域的突触环路中,进而形成具有功能的海马。新生神经元具有较高的兴奋性,更有助于产生长时程增强(Long-term potentiation, LTP),这一点有别于成熟的颗粒神经元。对于啮齿目动物,给予Ap能导致海马长时程增强电位发生变化,从而损坏认知和记忆功能。有证据表明,绝经后妇女卵巢激素的耗竭会增加AD的患病风险,而雌激素治疗可以改善AD患者非文字记忆能力,减少Ap积聚。此外,雌激素受体(Estrogen receptor, ER)的激活可以增加海马神经的再生功能。雌二醇(17p-estradiol, E2)浓度的升高或降低能迅速改变海马CA1区神经元中树突棘的密度和形态,这一点可以在切除卵巢的雌性小鼠中观察到。对于雄性草原田鼠,雌二醇治疗能够增强新生神经元的生存能力。在突触水平,血清雌二醇水平的提高可以增加海马CA1突触LTP的幅值。尽管越来越多的证据显示,在AD模型鼠中,雌二醇从神经病理学和行为学方面均有神经保护作用,但是其机制还未阐明。研究表明,MAPKs信号通路与Ap的异常沉积及神经毒性有关,这可能是由于Ap的异常沉积激活了MAPKs通路,进而触发了细胞凋亡。活化的AKT可以磷酸化一系列底物蛋白,从而传递细胞生存或者抑制细胞凋亡的信号,有文献报道,E2在脑损伤保护中可以通过激活AKT通路来调节脑损伤保护。雌激素预防老年痴呆的机制可能涉及：促进神经突触生长,增加神经生长因子的表达水平；通过调控MAPK、AKT等信号通路蛋白的表达,减少Ap的沉积；抗氧化、抗炎也可能参与了其神经毒性过程。然而,E2如何调控信号通路行使神经保护的功能,仍需进一步研究。第一部分雌二醇对Aβ25-35诱导海马新生神经元损害的保护作用目的：本研究利用Aβ25-35侧脑室内注射方法建立阿尔茨海默病(AD)模型小鼠,并给予雌二醇(E2)干预。采用Morris水迷宫检测小鼠的空间认知及学习记忆能力；利用免疫组化法检测BrdU、DCX阳性神经元；利用海马脑片场电位记录检测EPSPs及LTP幅值。探讨雌二醇对Aβ25-35诱导AD小鼠空间认知及学习记忆能力的改善作用；探讨Aβ25-35对小鼠海马齿状回新生神经元存活、EPSPs及LTP幅值的影响；探讨雌二醇对Aβ25-35损害的海马新生神经元的保护作用及对EPSPs及LTP幅值的影响。方法：1.阿尔茨海默病动物模型的制备：小鼠侧脑室内注射Aβ25-35 (3nmol/3μl),制备Ap诱导AD模型,对照组注射等量生理盐水。2.脑片的制备：小鼠用乙醚深麻醉后断头,迅速取出脑。将振动切片机放置在冰冷的切片溶液中,以冠状位切成厚度为400μm的脑片。3.长期雌二醇(E2)干预分组：小鼠侧脑室内注射Aβ25-35 (3nmol/3μl),制备Aβ诱导AD模型,对照组注射等量生理盐水,再腹腔注射BrdU,50mg/kg,间隔6小时,连续给药3次。BrdU注射后第6-28天,在小鼠皮下注射雌二醇。对照组按BrdU注射后第14(n=8)、21(n=8)、28(n=14)天分为3个亚组；模型组按BrdU注射后第14(n=8)、21(n=8)、28(n=14)天分为3个亚组;长期E2治疗+对照组(皮下注射E2,10μg/day, n=8);长期E2治疗+模型组(皮下注射E2,10μg/day,n=14)。4.短期雌二醇(E2)干预分组：小鼠在BrdU腹腔注射后第25天侧脑室注射Aβ25-35建立模型,对照组注射等量生理盐水,然后给予3天雌二醇皮下注射。对照组(n=8)；模型组(n=14)；短期E2治疗+对照组(3天E2皮下注射,10μg/day,n=8)；短期E2治疗+模型组(3天E2皮下注射,10μg/day, n=14)。5.AD小鼠造模后第6-28天给予雌二醇治疗,对照组注射等量生理盐水,采用Morris水迷宫检测小鼠的空间认知能力及学习记忆功能。对照组(n=8)；模型组(n=8);E2治疗+对照组(E2皮下注射,10μg/day, n=8);E2治疗+模型组(皮下注射E2,1、5、10、15、20μg/day, n=40)。6. BrdU免疫染色：在分裂细胞的DNA合成期,BrdU作为脱氧胸腺嘧啶类似物,掺入DNA单链中,用免疫组化法检测BrdU阳性细胞,即可标记新生的细胞。7.DCX免疫染色：DCX作为神经元前体细胞的标志物,不在中枢神经系统成熟神经元中表达,用免疫组化的方法检测DCX阳性细胞,用来研究神经元前体细胞的增殖和迁移。8.LTP检测：利用5 MΩ阻抗的玻璃微电极记录齿状回分子层的兴奋性突触后电位。利用条件刺激(conditioning stimuli, CS)来诱导LTP, EPSP斜坡大于20%,则LTP确定。结果：1.E2改善了AD小鼠空间认知能力及学习记忆功能(P<0.01),10μg/day E2皮下注射,具有明显的剂量依赖关系。2. BrdU染色表明,在BrdU后注射第14天、21天、28天,与对照组相比,Aβ25-35诱导AD模型组小鼠第21天和28天的BrdU阳性细胞数目明显减少(P<0.01),而第14天的BrdU阳性细胞数,两组之间没有明显差异(P>0.05)。3.DCX染色检测结果表明,DCX的表达在第二周达到峰值,与对照组相比,Aβ25-35诱导AD模型组小鼠DCX阳性细胞内突触密度明显下降(P<0.01)。4.与对照组相比,Aβ25-35诱导AD模型组小鼠海马齿状回区域的EPSP斜率降低(P<0.05)。高频刺激激发对照组小鼠海马齿状回稳定增强的EPSP斜率,却不能激发Aβ25-35诱导AD模型组小鼠海马齿状回中的长时程增强效应。5.长期雌二醇注射轻度增加对照组BrdU阳性细胞数(P>0.05),而Aβ25-35诱导AD模型组BrdU阳性细胞数增加更显著(P<0.01)。并且明显提高AD模型组小鼠的EPSP斜率(P<0.05),增强AD模型组小鼠的长时程增强效应。6.短期雌二醇治疗能够轻度增加对照组和AD模型组小鼠第28天BrdU阳性细胞数目,但对照组与雌二醇治疗的对照组小鼠之间、AD模型组与雌二醇治疗的AD模型组小鼠之间,BrdU阳性细胞数差别没有统计学意义(P>0.05)。短期雌二醇治疗虽然提高了EPSP斜率(P<0.05),却未能激发AD模型小鼠的长时程增强效应。结论：1.雌二醇治疗可以改善Aβ25-35诱导AD小鼠的空间认知及学习记忆能力。2.Aβ25-35诱导AD模型小鼠损害海马齿状回新生神经元的存活和新生神经细胞突触的生长。3.Aβ25-35诱导AD模型小鼠抑制海马齿状回中长时程增强诱导。4.长期雌二醇治疗能改善Aβ25-35诱导AD模型小鼠海马齿状回新生神经元存活及长时程增强诱导,而短期雌二醇注射无明显的改善作用。5.雌二醇对Aβ25-35诱导AD模型小鼠损害的海马齿状回LTP诱导效应的改善可能依赖于其对新生神经元的保护作用。第二部分雌二醇通过调控MAPKs、AKT通路抑制A β 25-35诱导的神经元细胞凋亡目的：体外培养大鼠起源的海马神经元细胞系HT22,体外构建Aβ25-35细胞损伤模型,检测Aβ25-35体外诱导的神经毒性及分子机制；评价E2在体外拮抗Aβ25-35诱导的神经毒性的效果和分子机制。方法：1.细胞培养：体外培养HT22细胞系,高糖DMEM培养基添加10%胎牛血清,1%双抗,37℃,5%二氧化碳,培养箱培养,待细胞稳定指数增长时用于以下实验。2.体外模型构建：HT22细胞以5000细胞/孔接种96孔板,37℃,5%二氧化碳,预培养24 h待细胞贴壁。随机分为4个组：对照组、Aβ25-35组、E2组、E2+Aβ25-35组;Aβ25-35组又分4个亚组(分别加入Aβ25-355、10、20、40gM),E2组又分3个亚组(分别加入E20.01、0.1、1.0μM)。Aβ25-35组分别加入5μM、10EM、20μM、40μM的Aβ25-35处理24 h;E2组分别加入0.0.1μM、0.1μM、1.0μME2处理24 h;E2+Aβ25-35组,E2(1.0μM)提前预处理HT22细胞1 h后,加入Aβ25-35(10μM)继续处理24小时。3.MTT检测细胞活性：药物处理结束后,MTT方法检测细胞成活率,以正常对照组细胞活性为100%,计算药物处理组的细胞活性百分比。4.细胞形貌的改善：相差显微镜观察HT22细胞细胞形貌的改变。主要观测指标为：细胞数量、细胞形状、细胞与细胞之间的连接等。5. TUNEL-DAPI双染检测细胞凋亡：采用TUNEL-DAPI双染检测神经元细胞凋亡。6. Western blotting检测信号通路蛋白的表达：Western blotting检测MAPKs (p38、JNK、ERK)和]PI3K/AKT信号通路的表达情况。结果：1.MTT结果表明：Aβ25-35在体外处理HT22细胞,可剂量依赖性的抑制HT22细胞生长(P<0.01),E2在24 h内无明显细胞毒性(P>0.05)；然而,E2预处理HT22细胞,可显著减弱Aβ25-35诱导的细胞活性的降低(P<0.01)。2. TUNEL-DAPI双染结果表明：Aβ25-35处理可显著诱导HT22细胞凋亡,表现为TUNEL阳性细胞的增多(P<0.01)；然而,E2预处理可显著降低Aβ25-35诱导的HT22细胞凋亡,表现为TUNEL阳性细胞的减少(P<0.01)。3.机制研究表明：Aβ25-35处理可显著影响MAPKs通路和PI3K/AKT通路蛋白的表达,表现为磷酸化JNK、磷酸化p38表达的激活(P<0.01),磷酸化ERK蛋白的失活以及磷酸化AKT蛋白的失活(P<0.01)；然而,E2预处理显著抑制了Aβ25-35诱导的磷酸化JNK、磷酸化p38表达的激活(P<0.01),抑制了磷酸化ERK蛋白的失活以及磷酸化AKT蛋白的失活(P<0.01)。结论：1.Aβ25-35在体外可剂量依赖性的抑制HT22细胞细胞生长,表现出明显的神经元毒性；E2在体外可减弱Aβ25-35对HT22的细胞毒性。2.Aβ25-35处理显著诱导了神经元细胞凋亡,表现为TUNEL阳性细胞的增多；E2处理显著抑制了Aβ25-35诱导的神经元凋亡,表现为TUNEL阳性细胞的减少。3.Aβ25-35处理显著诱导了MAPKs通路的异常磷酸化,表现为磷酸化的p38、JNK的上调,ERK蛋白磷酸化表达水平下调；E2在体外可显著改善Aβ25-35诱导的MAPKs通路表达的异常。4.Aβ25-35处理可显著抑制AKT蛋白的磷酸化,E2可抑制Aβ25-35诱导的AKT的失活。